不同特性PLGA納米內(nèi)耳給藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與評價(jià).pdf

1、典型的內(nèi)耳疾病涉及到整個(gè)膜迷路，其表現(xiàn)為引起感覺神經(jīng)性耳聾、耳鳴和眩暈，嚴(yán)重影響人體聽覺與平衡。臨床上常采用鼓室（IT）給藥來治療內(nèi)耳疾病，藥物主要通過圓窗膜（RWM）滲透進(jìn)入內(nèi)耳。RWM的通透性受到物質(zhì)的大小、表面性質(zhì)、促滲劑等因素的影響。聚乳酸羥基乙酸（PLGA）納米粒（NPs）作為藥物載體及穿膜肽作為促滲劑，均能夠促進(jìn)藥物通過RWM。因此，本研究設(shè)計(jì)制備具有不同特性PLGA-NPs，包括不同粒徑與不同表面性質(zhì)，并將NPs混合穿膜肽

2、，采用近紅外成像系統(tǒng)對NPs進(jìn)入耳蝸的程度進(jìn)行評價(jià)，期望構(gòu)建一個(gè)更為有效的納米內(nèi)耳藥物遞送系統(tǒng)。
　　采用單乳化溶劑揮發(fā)法制備香豆素-6 PLGA-NPs，單因素考察其制備工藝，發(fā)現(xiàn)PVA濃度、水油比和超聲時(shí)間對粒徑影響較大，PLGA分子量、濃度和超聲功率影響較小。通過改變制備工藝中的有機(jī)相、PVA濃度、水油比和超聲時(shí)間及功率，制備出不同粒徑的PLGA-NPs，平均粒徑分別為小于100 nm（79.9 nm）、100-200 nm

3、（157.5 nm）、200-400 nm（302.7 nm），對應(yīng)的多分散系數(shù)（PDI）分別為0.158、0.117和0.198。Zeta電位分別為-14.74、-13.32和-7.41 mV。以凍干后NPs外觀、復(fù)溶性、粒徑及PDI為指標(biāo)，考察NPs凍干儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，加入2％的甘露醇作為NPs的凍干保護(hù)劑最為合適。不同粒徑范圍的NPs加入2%的甘露醇凍干后于常溫下儲(chǔ)存1周、3周和2個(gè)月，NPs復(fù)溶后的粒徑及粒徑分布趨勢與凍

4、干前基本一致，提示在該條件下NPs凍干儲(chǔ)存，其穩(wěn)定性可達(dá)2個(gè)月。
　　利用帶正電荷的殼聚糖（CS）能夠靜電吸附在帶負(fù)電荷的PLGA-NPs表面上，制成CS修飾的PLGA-NPs。紅外光譜和X射線光電子能譜測定結(jié)果表明CS修飾PLGA NPs表面CS氨基的存在，提示CS成功修飾在NPs的表面。X射線衍射分析說明CS吸附在NPs的表面時(shí)，CS的晶型發(fā)生了改變，變成了無定形狀態(tài)。制備了不同粒徑CS-PLGA-NPs，平均粒徑分別為100

5、-200 nm（173.9 nm）、200-400 nm（276.5和313.7nm），對應(yīng)的PDI分別為0.292、0.262和0.204，Zeta電位分別為18.47、10.70和1.37 mV；采用茚三酮試驗(yàn)法測定表面CS的吸附量分別為0.047±0.007、0.110±0.072和0.106±0.012 mg·mg-1（n=3）。利用泊洛沙姆407（P407）疏水端的聚環(huán)氧丙烯通過疏水作用力與疏水的PLGA-NPs結(jié)合，將P40

6、7修飾在NPs上。制備了不同粒徑的P407-PLGA-NPs，平均粒徑分別是小于100 nm（77.2 nm）、100-200 nm（177.4 nm）和200-400 nm（296.9 nm），對應(yīng)的PDI分別為0.131、0.127和0.174，Zeta電位分別為-7.33、-15.90和-3.08 mV；利用P407中聚氧乙烯片段與硫氰酸鈷試劑形成有色復(fù)合物來測定NPs上P407的吸附量，分別為34.10±4.78、32.47±2

7、.67和28.71±1.10μg·mg-1（n=3）。采用mPEG-PLGA聚合物制備了不同粒徑的mPEG修飾的PLGA-NPs，平均粒徑分別為小于100 nm（67.0 nm）、100-200 nm（142.8 nm）和200-400 nm（211.9 nm），對應(yīng)的PDI分別為0.169、0.162和0.243，Zeta電位分別為-10.79、-12.36和-7.58 mV。采用冷凍超速離心法測得所制得的NPs的包封率，均在80%以

8、上，磷鎢酸負(fù)染法透射電鏡下觀察，NPs形狀圓整，分布均勻，無粘連。
　　采用熒光成像系統(tǒng)評價(jià)不同特性的PLGA-NPs透過RWM進(jìn)入耳蝸的體內(nèi)行為。與包載香豆素-6 NPs相比，應(yīng)用載近紅外熒光探針DiR的NPs經(jīng)IT給藥考察離體耳蝸，背景干擾較少。豚鼠分別IT給藥和靜脈（IV）給藥DiR-NPs，在體成像發(fā)現(xiàn)IV給藥后，NPs主要積聚在肝部位；離體組織成像發(fā)現(xiàn)IT給藥后，NPs主要聚集在耳蝸處。說明，IT給藥相比IV給藥，能使N

9、Ps在耳蝸處達(dá)較高濃度，避免被肝脾清除。不同粒徑的DiR-NPs經(jīng)IT給藥0.5 h后，300 nm NPs在耳蝸的熒光強(qiáng)度顯著高于80 nm（p<0.05），而與150 nm NPs相差不大；IT給藥24 h后，80 nm的NPs在耳蝸的熒光強(qiáng)度更高。不同修飾的DiR-NPs在IT給藥0.5 h后，CS-PLGA-NPs在耳蝸的熒光強(qiáng)度顯著高于未修飾、P407-和 mPEG-PLGA-NPs（p<0.001）；IT給藥24 h后。P4

10、07-PLGA-NPs在耳蝸的熒光強(qiáng)度高于其他NPs（p<0.001）。提示不同粒徑、修飾的PLGA-NPs透過RWM進(jìn)入耳蝸的速度和程度不同。
　　而且，進(jìn)一步應(yīng)用熒光成像系統(tǒng)考察不同穿膜肽（TAT、Penetratin、LMWP和R8）對PLGA-NPs透膜進(jìn)入耳蝸的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)穿膜肽能促進(jìn)NPs進(jìn)入到耳蝸，且LMWP的作用最強(qiáng)（p<0.05）。LMWP分別混合不同 NPs（PLGA-NPs與P407-PLGA-NPs）IT

11、給藥0.5 h后，P407-PLGA-NPs和混合LMWP的NPs在耳蝸的熒光強(qiáng)度高于PLGA-NPs（p<0.05），且混合LMWP的P407-PLGA-NPs的熒光強(qiáng)度最高，說明P407-PLGA-NPs跨RWM的能力更強(qiáng)，且LMWP能夠進(jìn)一步增強(qiáng)這種能力。
　　綜上所述，通過改變制備條件可以制備出不同粒徑的NPs，利用PLGA-NPs表面的電荷和表面的疏水性可以分別制備出CS和P407修飾的NPs。研究結(jié)果表明，NPs通過粒