丙酮酸高分泌型菌種的選育及其相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、本文著重研究了以細(xì)菌-運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)為出發(fā)菌種,利用物理和化學(xué)誘變劑對(duì)其進(jìn)行逐步多次多因子復(fù)合誘變,通過(guò)碳酸鈣-紅四氮唑(TTC)篩選平板,篩選獲得了一株高產(chǎn)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌突變株--Z.m-4,該株產(chǎn)丙酮酸為2.75g/l、發(fā)酵時(shí)間為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的一半左右,大大提高了丙酮酸的產(chǎn)生效率。獲得的主要結(jié)論如下:1.通過(guò)測(cè)定運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在含有不同葡萄糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)的OD600值(

2、600nm下的吸光度值),建立了其在不同糖濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線,確定了發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳的葡萄糖含量為50g/L,發(fā)酵時(shí)間為33h。2.產(chǎn)丙酮酸菌株的生長(zhǎng)環(huán)境為酸性,因此對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行耐酸性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)設(shè)置種子培養(yǎng)基的pH值梯度:6.5、6.0、5.5、5.0、4.5及4.0。將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌按照pH由高到低接種到種子培養(yǎng)基上,通過(guò)傳代培養(yǎng),使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌逐步適應(yīng)酸性環(huán)境,獲得耐酸性突變株Z.m-1。為最后丙酮酸高分泌菌種的

3、獲得打下良好的基礎(chǔ)。3.利用產(chǎn)丙酮酸的菌落可以和碳酸鈣平板反應(yīng)形成透明圈以及TTC可以與ADH酶作用而顯色的原理,確定了以碳酸鈣-TTC復(fù)合平板為主要篩選平板的突變菌株篩選方式。4.采用對(duì)Z.m-1進(jìn)行硫酸二乙酯(DES)和紫外線多因子誘變處理,獲得了高產(chǎn)丙酮酸突變株。通過(guò)設(shè)置紫外線照射劑量梯度,計(jì)算因照射而造成的致死率,確定了紫外線的最適照射劑量為400S。DES的工作濃度為2%(v/v)和處理時(shí)間為30min。從出發(fā)菌株為不產(chǎn)丙酮酸

4、的Z.m-1中,通過(guò)誘變篩選獲得了一株產(chǎn)丙酮酸量為0.92g/L且遺傳穩(wěn)定性良好的突變株--Z.m-2。5.通過(guò)對(duì)單一菌種進(jìn)行多次誘變,可以適當(dāng)降低誘變劑的劑量的原則,確定紫外線照射時(shí)間為320S,較最佳紫外照射時(shí)間減少了80S,甲基磺酸乙酯(EMS)工作濃度為0.1mol/L和處理時(shí)間為30min。通過(guò)對(duì)Z.m-2進(jìn)行紫外線和EMS多因子誘變及熱處理后,篩選獲得了一株產(chǎn)酸量為2.67g/L的突變株--Z.m-3。6.利用紫外線和亞硝基

5、胍(NTG)多因子誘變以及熱處理對(duì).Z.m-3進(jìn)行誘變。紫外線的照射時(shí)間繼續(xù)降低80S,確定為240S。NTG工作濃度為0.1mg/ml,處理時(shí)間為30min。獲得了一株產(chǎn)酸量為2.75g/L的突變株--Z.m-4。7.通過(guò)對(duì)Z.m-4菌株的ADH酶和PDC酶酶活性的測(cè)定,可以得到,相對(duì)于誘變前的出發(fā)菌株,Z.m-4菌株的ADH酶活性降低了106Umol/min.g,PDC酶活性降低了274Umol/min.g。8.通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液中的還

6、原糖含量,得到葡萄糖-丙酮酸的轉(zhuǎn)化率6.60%,由此印證了Z.m-4突變株中ADH和PDC酶活性并沒(méi)有被完全抑制,即丙酮酸-乙醇的代謝途徑?jīng)]有完全被切斷。9.由于出發(fā)菌株是細(xì)菌,細(xì)菌的發(fā)酵周期通常要比酵母縮短近一半,傳統(tǒng)的光滑球擬酵母發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸發(fā)酵周期為60h左右,而本實(shí)驗(yàn)獲得的突變株發(fā)酵周期為33h,提高了工作效率。此研究為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸工業(yè)化的進(jìn)程提供了一條新的思路。
   運(yùn)動(dòng)型飲料分別進(jìn)行加熱滅菌和微孔膜過(guò)

7、濾法兩種方法滅菌處理,檢測(cè)處理過(guò)的飲料在儲(chǔ)存過(guò)程中微生物總量變化及大腸桿菌數(shù)量的變化,從而為這種飲料投入大規(guī)模規(guī)范性生產(chǎn)操作提供依據(jù)。方法:分別以營(yíng)養(yǎng)瓊脂、Aliz-gal瓊脂MUGal肉湯作為培養(yǎng)基,采取平皿培養(yǎng)法對(duì)經(jīng)過(guò)加熱滅菌法和微孔膜過(guò)濾法的飲料進(jìn)行微生物總量和大腸桿菌的檢測(cè)。結(jié)果:四個(gè)溫度的高溫滅菌及微孔膜過(guò)濾后所得的飲料樣品在30天內(nèi)總菌落數(shù)均小于10個(gè)/ml,大腸桿菌MPN均小于3/100ml。結(jié)論:70℃高溫滅菌及0.45

8、um微孔膜膜過(guò)濾處理后的飲料即可獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定的無(wú)菌飲料。
   輔課題中進(jìn)行了雞糞和酒糟混合發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究。以雞糞和酒糟為原料,在單因次考察基礎(chǔ)上,利用正交試驗(yàn)對(duì)混合發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白飼料工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,最佳預(yù)處理?xiàng)l件為50ml/kg濃硫酸處理雞糞300s;最佳發(fā)酵生產(chǎn)條件:雞糞和酒糟比為3:7,尿素添加量3%,硫酸銨3%,玉米粉15%,金寶貝助酵劑0.4%,含水量60%,pH7.0,30℃,5d。最佳條件下粗蛋白

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