深海產(chǎn)黑色素細(xì)菌性質(zhì)研究及HPPD抑制劑篩選模型構(gòu)建.pdf

1、黑色素（Melanin）是一類(lèi)腐殖質(zhì)型大分子化合物的泛稱(chēng)，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，屬于非均質(zhì)的類(lèi)多酚聚合體，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體中。黑色素雖然對(duì)于生物的生長(zhǎng)和發(fā)育并非是必不可少的，但卻能提高生物生存競(jìng)爭(zhēng)的能力。
　　對(duì)羥苯基丙酮酸雙加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvic acid dioxygenase，4-HPPD，EC1.13.11.27）是酪氨酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，催化4-羥苯基丙酮酸（4-hydroxyph

2、enylpyruvate，4-HPP）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚝谒幔℉omogentisic acid，HGA）的反應(yīng)。尿黑酸是植物體內(nèi)合成質(zhì)體醌和生育酚（維生素E）的重要前體物質(zhì)，對(duì)4-HPPD的抑制作用可引起植物產(chǎn)生白化現(xiàn)象。HPPD抑制劑作為一種生物安全性好的除草劑，是當(dāng)前生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。
　　本文從大西洋深海沉積物中分離得到一株產(chǎn)黑色素細(xì)菌 bIp-2。16S rDNA序列分析表明該菌與施氏假單胞菌（Pseudomonasstutze

3、ri）有最高的序列相似性（同源性99％）。對(duì)該菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)黑色素的特性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明：bIp-2在對(duì)數(shù)期后期才開(kāi)始大量積累黑色素，為典型的次級(jí)代謝產(chǎn)物；bIp-2可在4℃～37℃的溫度范圍下生長(zhǎng)，在28℃具有最高的黑色素產(chǎn)量；生長(zhǎng)的pH范圍偏堿性，在pH7的最適生長(zhǎng)條件下黑色素產(chǎn)量最高,同時(shí)堿性環(huán)境有利于黑色素的快速形成；可以在1%～9%的鹽度范圍中生長(zhǎng)，在5%的鹽度下具有最高的黑色素產(chǎn)量。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得大小為1087 b

4、p的hppD全長(zhǎng)基因并在大腸桿菌中異源表達(dá)了該蛋白。Blastx分析發(fā)現(xiàn)克隆得到的hppD基因編碼的長(zhǎng)361 aa的多肽與來(lái)自菌株P(guān)seudomonas stutzeri RCH2的4-HPPD蛋白序列具有最高的同源性（97%）。利用以上菌株及其功能基因異源表達(dá)的產(chǎn)色素現(xiàn)象嘗試構(gòu)建微生物方法的 HPPD抑制劑篩選手段，使用來(lái)自產(chǎn)黑色素菌 bIp-2的 hppD基因異源表達(dá)的克隆子的產(chǎn)色素現(xiàn)象，以現(xiàn)有已經(jīng)商品化的HPPD抑制劑的脫色作用為