鏈霉菌AM-7161遺傳操作系統(tǒng)的建立和糖基轉(zhuǎn)移酶基因med-ORF8原核表達(dá)的研究.pdf

1、鏈霉菌（Streptomyces sp AM-7161，縮寫(xiě)AM-7161）可以產(chǎn)生具有抗癌抗菌活性的芳香聚酮抗生素美達(dá)霉素（medermycin）。美達(dá)霉素生物合成中許多后期修飾步驟（比如有關(guān)脫氧六糖碳基的合成、C-糖基轉(zhuǎn)移以及立體異構(gòu)的形成）都是令人感興趣的問(wèn)題。但針對(duì)這個(gè)菌株的遺傳操作一直非常困難，限制了對(duì)這些問(wèn)題的研究，因此本研究首先對(duì)這個(gè)菌株的遺傳操作系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，然后對(duì)美達(dá)霉素生物合成中的C-糖基轉(zhuǎn)移酶基因med-ORF8

2、的原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了摸索。 （1）菌株AM-7161遺傳操作系統(tǒng)的建立和優(yōu)化：首先對(duì)菌株AM-7161的培養(yǎng)條件、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和再生的條件進(jìn)行了優(yōu)化；在此基礎(chǔ)上，從大腸桿菌DH5α細(xì)胞中提取的兩種質(zhì)粒（整合型質(zhì)粒pSET152和自主復(fù)制型質(zhì)粒pWHM4*）通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以高效率導(dǎo)入這個(gè)菌株（轉(zhuǎn)化效率可達(dá)102-103轉(zhuǎn)化子/微克DNA）。同時(shí)，優(yōu)化了菌株AM-7161與大腸桿菌之間的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，外源DNA也可

3、通過(guò)接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)入AM-7161。結(jié)果表明，在這個(gè)菌株中進(jìn)行遺傳操作的條件已經(jīng)建立，可以對(duì)一些美達(dá)霉素生物合成酶基因（如med-ORF8）展開(kāi)體內(nèi)功能遺傳學(xué)分析（如突變分析或互補(bǔ)分析），同時(shí)也說(shuō)明此菌株對(duì)甲基化的外源DNA不存在限制性，其染色體上含有pSET152的整合位點(diǎn)； （2） med-ORF8原核表達(dá)體系的建立：med-ORF8位于美達(dá)霉素生物合成基因簇中，是美達(dá)霉素合成必需的基因，推測(cè)參與了美達(dá)霉素的C-C糖苷鍵的形