合成Ⅱa類廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選及合成和分離的研究.pdf

1、Ⅱa類細(xì)菌素是一種對(duì)單增李斯特氏菌具有強(qiáng)烈的抑菌活性，且在N端具有YGNGVXCXXXXCXV保守序列的細(xì)菌素，乳酸菌產(chǎn)生的Ⅱa類細(xì)菌素由于具有抑菌譜廣、穩(wěn)定性高、分散性好、安全高效、能作為天然防腐劑等優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注。但乳酸菌產(chǎn)生的廣譜Ⅱa類細(xì)菌素的傳統(tǒng)篩選方法的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不能直接鑒定為Ⅱa類細(xì)菌素，分離純化步驟繁瑣，生物合成量低是限制其產(chǎn)業(yè)化的三大瓶頸。如果能夠建立一種快速簡捷的篩選方法直接鑒定Ⅱa類細(xì)菌素、縮短分離純化步驟、提高其

2、生物合成量，對(duì)Ⅱa類細(xì)菌素的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。
　　本論文以實(shí)驗(yàn)室前期收集、篩選保存的乳酸菌為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了具有廣譜抑菌活性乳酸菌細(xì)菌素的篩選，建立了直接鑒定Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的平臺(tái)，提高了篩選得到的具有廣譜抑菌作用的Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的生物合成量，建立了Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的新的快速分離工藝，研究了Ⅱa類乳酸菌細(xì)菌素的理化性質(zhì)。
　　利用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的142株乳酸菌進(jìn)行了具有廣譜抑菌活性的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌

3、的篩選，經(jīng)過排除有機(jī)酸、過氧化氫及蛋白酶驗(yàn)證，最終篩選出菌株IN3432、Y31、Y33、IN3521、IN3922、SP1.1、94.3、IN3821共8株乳酸菌具有產(chǎn)廣譜乳酸菌細(xì)菌素的能力。
　　基于Ⅱa類細(xì)菌素在N端具有YGNGVXCXXXXCXV保守序列的特征，建立了基于YGNGV-位點(diǎn)的直接鑒定產(chǎn)Ⅱa類細(xì)菌素乳酸菌的高通量篩選平臺(tái)；利用此平臺(tái)從上述8株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌中鑒定出3株乳酸菌（Y33、Y31、SP1.1）具有產(chǎn)

4、Ⅱa類細(xì)菌素的能力。其中菌株Y31和菌株Y33與Genebank數(shù)據(jù)庫中的Ⅱa類細(xì)菌素的基因編碼序列同源性最高，綜合菌株 Y31的抑菌活性最強(qiáng)且相對(duì)更為穩(wěn)定，所以選擇菌株Y31進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步的研究。經(jīng)菌落、菌體形態(tài)、API生理生化及16S rDNA鑒定菌株 Y31為屎腸球菌 Enterococcus faecium。
　　利用化學(xué)定義培養(yǎng)基來培養(yǎng)產(chǎn)Ⅱa類細(xì)菌素乳酸菌 Enterococcus faecium Y31，不添加任何蛋白

5、質(zhì)和肽，單純通過調(diào)節(jié)各種化學(xué)定義培養(yǎng)基的純的氨基酸成分、維生素和礦物質(zhì)等成分，提出了一個(gè)能提高細(xì)菌素Enterocin Y31產(chǎn)量的新方法；研究結(jié)果表明產(chǎn)Ⅱa類細(xì)菌素乳酸菌Enterococcus faecium Y31的生長與細(xì)菌素Enterocin Y31產(chǎn)量沒有直接的線性關(guān)系；利用缺一交叉試驗(yàn)確定了提高細(xì)菌素 Enterocin Y31產(chǎn)量的新的化學(xué)定義培養(yǎng)基 SDM；比較 SDM中Enterocin Y31的產(chǎn)量和MRS中Ent

6、erocin Y31的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)SDM中EnterocinY31的產(chǎn)量是MRS中Enterocin Y31的產(chǎn)量的1.6倍。
　　發(fā)現(xiàn)了利用化學(xué)定義培養(yǎng)基-超濾聯(lián)合優(yōu)化Ⅱa類細(xì)菌素生物合成量后，細(xì)菌素Enterocin Y31的分離純化更為簡便，僅為超濾和電泳兩步，并將其新的分離純化方法與常規(guī)的分離純化方法（細(xì)胞膜吸附、離子交換色譜、透析、疏水層析、反向色譜）純度和得率進(jìn)行了比較，化學(xué)定義培養(yǎng)基-超濾的回收率為80％，而常規(guī)的分離

7、純化方法為6.4%，化學(xué)定義培養(yǎng)基-超濾方法比常規(guī)方法提高了12.5倍，純度都達(dá)到了質(zhì)譜測(cè)序要求，化學(xué)定義培養(yǎng)基-超濾聯(lián)合的方法避免了Enterocin Y31下游加工的損耗和在分離純化過程中多步驟帶來的活性完全喪失的風(fēng)險(xiǎn)，具有顯著的優(yōu)勢(shì)。Enterocin Y31的分子量是6.7kDa,含有10種氨基酸，其中Met含量最高，部分氨基酸序列是N-T-A-H-S-D-F-N-R。
　　開展了細(xì)菌素Enterocin Y31抑菌譜及理

8、化性質(zhì)的研究，結(jié)果表明Enterocin Y31具有廣譜的抑菌活性，其中對(duì)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633、大腸桿菌 Escherichia coli ATCC25922、李斯特氏菌 Listeria monocytogenes ATCC19111、梭狀芽孢桿菌 Bacillus cereus CICC20463、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)沙門氏菌 Sal

9、monella enterica serovar Typhimurium ATCC14028有較弱的抑制作用。Enterocin Y31等電點(diǎn)為8.25。Enterocin Y31在酸性和弱堿性環(huán)境下穩(wěn)定、有一定的熱穩(wěn)定性、對(duì)蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶敏感，不能被脂肪酶和α-淀粉酶水解。Enterocin Y31對(duì)無機(jī)鹽NaCl、蛋白酶抑制劑EDTA和三種去污劑有一定的承受能力，其中降低細(xì)菌素抑菌活性最明顯的是1.0%SD