酶法再生輔酶NAD(P)H循環(huán)體系的構建及其應用初步研究.pdf

1、氧化還原酶廣泛應用于催化制備手性醇、羥基酸、氨基酸等方面。大多數(shù)的氧化還原酶催化反應都需要輔酶，在其所需輔酶中，NAD(P)+-NAD(P)H體系占90％左右。但這些輔酶價格昂貴，限制了氧化還原酶的應用。采用基因工程技術對酶法再生輔酶中的關鍵酶進行克隆和高表達是解決氧化還原酶輔酶再生的關鍵。赭色擲孢酵母中乙醛還原酶可以催化4-氯-乙酰乙酸乙酯(COBE)為(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(R-CHBE)，該不對稱還原反應需要還原性輔酶N

2、ADPH參與，因此R-CHBE的高效制備需要輔酶再生循環(huán)的耦合。
　　 本論文的主要內(nèi)容包括：①高效表達甲酸脫氫酶構建輔酶NADH再生體系；②高效表達葡萄糖脫氫酶構建輔酶NADPFH再生體系；③乙醛還原酶的克隆和表達；④乙醛還原酶與輔酶再生體系偶聯(lián)轉(zhuǎn)化4-氯-乙酰乙酸乙酯。
　　 本論文首先構建了高效的輔酶NADH再生系統(tǒng)：根據(jù)甲酸脫氫酶基因序列，設計引物，擴增甲酸脫氫酶基因，構建重組質(zhì)粒pET-fdh轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌進

3、行表達，經(jīng)過宿主和載體、誘導時間、誘導溫度等參數(shù)優(yōu)化，重組菌中甲酸脫氫酶比酶活達到0.409U/mg蛋白，重組蛋白表達量約占全菌可溶性蛋白的17％，得到了高效表達甲酸脫氫酶的重組菌Rosetta/pET-fdh。
　　 本論文構建了高效的輔酶NADPH再生系統(tǒng)：根據(jù)葡萄糖脫氫酶基因序列設計引物，擴增葡萄糖脫氫酶基因，構建重組質(zhì)粒pET-gdh并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌進行表達。重組菌葡萄糖脫氫酶比酶活高達9.65U/mg蛋白，重組蛋白表達

4、量占全菌可溶性蛋白的53％。獲得了高產(chǎn)葡萄糖脫氫酶的基因工程菌株。
　　 本論文實現(xiàn)了乙醛還原酶在大腸桿菌中的高效表達，并研究了乙醛還原酶與輔酶再生體系耦合催化不對稱還原反應：通過RT-PCR從真核生物赭色擲孢酵母中克隆了乙醛還原酶cDNA序列，構建了重組表達載體pET-alr，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中。重組菌經(jīng)誘導后乙醛還原酶比酶活達到4.091U/mg蛋白，顯著高于原始菌株赭色擲孢酵母。以重組菌BL21/pET-alr和BL

5、21/pET-gdh雙菌混合選擇性還原COBE，產(chǎn)物CHBE的轉(zhuǎn)化率在7h時達到85.19％，22h后達到95.88％，產(chǎn)物R-CHBE的光學純度為92％。雙菌雙酶的COBE轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化速率均顯著優(yōu)于BL21/pET-alr的單菌轉(zhuǎn)化。該雙菌雙酶轉(zhuǎn)化體系無需添加輔酶，實現(xiàn)了高效的輔酶再生與耦合還原催化。
　　 本論文高效表達了甲酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，構建了良好的輔酶再生體系，并將葡萄糖脫氫酶和乙醛還原酶偶聯(lián)，大幅度提高了輔酶循