哺乳動(dòng)物細(xì)胞中EB1磷酸化的質(zhì)譜鑒定及功能分析.pdf

1、末端結(jié)合蛋白EB1是一種微管正末端追蹤蛋白（+TIPs），能夠自發(fā)地定位于微管的正末端而不依賴于其它任何分子。同時(shí)，EB1作為一個(gè)平臺(tái)，還能夠?qū)⒍喾N其他的+TIPs募集到微管的正末端。EB1由268個(gè)氨基酸殘基組成。N端是CH結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)介導(dǎo)EB1與微管的相互作用;C端是包含有EBH結(jié)構(gòu)域的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)介導(dǎo)EB1的二聚化，并介導(dǎo)EB1與其他+TIPs的相互作用;中間無定型結(jié)構(gòu)的連接區(qū)將EB1的N端和C端連接起來。EB1對(duì)于微管的

2、動(dòng)態(tài)性有重要調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)而參與微管介導(dǎo)的許多細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞極化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞有絲分裂等。但是，EB1功能的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，闡明此問題有助于深入了解EB1介導(dǎo)的細(xì)胞活動(dòng)。
　　本課題希望通過對(duì)EB1磷酸化的研究，來揭示EB1功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。首先，本課題通過質(zhì)譜的方法對(duì)在HeLa細(xì)胞系中過表達(dá)的GST-EB1蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)S27、T33、Y71、T135/S140、T154/S155/S156/S157、T165/S166

3、、T206和Y217等一系列磷酸化位點(diǎn)。然后，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果的可靠性和三維晶體結(jié)構(gòu)分析，本課題選擇部分位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過點(diǎn)突變的方法將鑒定出來的磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)椴荒芰姿峄男问胶湍M磷酸化的形式。通過生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段，本課題發(fā)現(xiàn)EB1磷酸化不影響EB1與微管蛋白的相互作用，而且不影響EB1定位于微管正末端的模式。通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞拍攝發(fā)現(xiàn)，EB1磷酸化促進(jìn)微管的動(dòng)態(tài)性，促進(jìn)微管平均生長速度，并促進(jìn)微管平均生

4、長長度。Y217磷酸化使EB1定位于微管正末端的能力減弱。Y217磷酸化還破壞EB1與MCAK、APC、CLIP170、p150Glued等+TIPs的相互作用，并破壞EB1自身二聚化的能力。但是，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，Y217磷酸化不改變細(xì)胞周期，且不影響有絲分裂紡錘體的定向和長度以及星體微管的密度。最后，我們發(fā)現(xiàn)Y217磷酸化使EB1蛋白質(zhì)更穩(wěn)定。由于Y217磷酸化提高EB1單體與二聚體的比例，此結(jié)果表明EB1單體比EB1二聚體更穩(wěn)定。