MicroRNA-520b調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞免疫逃逸作用和分子機(jī)制的研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼蛋白的短序列RNA片段,長(zhǎng)度大約為21～23個(gè)核苷酸。研究表明miRNAs參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等諸多過程,最近研究發(fā)現(xiàn)microRNA-520b(miR-520b)與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。CD46,CD55和CD59是一簇膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(mCRPs),在補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中可以通過抑制C5轉(zhuǎn)化酶阻止膜攻擊復(fù)合物(MAC)在腫瘤細(xì)胞表面的形成,抑制了補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒(complement-depe

2、ndent cytotoxicity,CDC)作用,保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受補(bǔ)體攻擊。但是,調(diào)節(jié)CRP的分子機(jī)制尚不清楚,miR-520b是否參與了補(bǔ)體介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸也未見報(bào)道。為了闡明乳腺癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)mCRPs的分子機(jī)制,我們研究了miR-520b或miR-520e在乳腺癌細(xì)胞中參與免疫調(diào)節(jié)的作用,研究應(yīng)用不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和LM-MCF-7(獲國(guó)家發(fā)明專利,ZL.0310107316)探討了miR-520b與CRP的關(guān)

3、系及其分子調(diào)控機(jī)制,主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1.miR-520b和miR-520e靶向CD46影響補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用及其分子機(jī)制研究
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞的microRNA芯片分析發(fā)現(xiàn),microRNA-520b在肝癌細(xì)胞中下調(diào)。為了進(jìn)一步研究microRNA-520b及與其高度同源的miR-520e在乳腺癌細(xì)胞中的作用及其與補(bǔ)體介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸的關(guān)系,我們首先應(yīng)用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

4、應(yīng)(quantitative RT-PCR)的方法檢測(cè)分析了miR-520b和miR-520e在正常的乳腺細(xì)胞HBL-100以及三株乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,LM-MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常的乳腺細(xì)胞HBL-100相比,乳腺癌細(xì)胞MCF-7，LM-MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中miR-520b和miR-520e的基因表達(dá)均下調(diào)。我們進(jìn)一步在8例正常乳腺組織和7例乳腺癌組織臨床標(biāo)本中比

5、較了miR-520b的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)miR-520b在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與正常乳腺組織中的表達(dá)水平相比顯著下調(diào),并發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系抵抗CDC的能力均高于正常乳腺細(xì)胞。為了進(jìn)一步研究miR-520b或miR-520e在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用的影響,我們外源轉(zhuǎn)染了合成的miR-520b或miR-520e的成熟體(mimics),以及miR-520b或miR-520e的抑制子(anti-mimics).CDC實(shí)驗(yàn)表明,在MCF

6、-7或MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR-520b或miR-520e均可增強(qiáng)CDC的作用,而在干擾了miR-520b或miR-520e的乳腺癌細(xì)胞中則抑制了其對(duì)CDC的敏感性。綜上結(jié)果表明,miR-520b和miR-520e參與了乳腺癌細(xì)胞中補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫抑制作用。
　　 為進(jìn)一步闡明miR-520b和miR-520e在乳腺癌細(xì)胞中參與補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫抑制的分子機(jī)理,我們應(yīng)用生物信息學(xué)軟件在TargetScan和DIA

7、NA microT3.0預(yù)測(cè)microRNA靶基因的數(shù)據(jù)庫中對(duì)miR-520b和miR-520e的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-520b和miR-520e均可以靶向與補(bǔ)體激活級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)有關(guān)的靶基因--膜輔助因子(membrane co-factor,MCP,CD46)。本研究發(fā)現(xiàn)在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中分別過表達(dá)miR-520b或miR-520e成熟體可以下調(diào)CD46蛋白質(zhì)表達(dá)水平,但不能影響CD46 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；當(dāng)分別過

8、表達(dá)miR-520b或miR-520e的抑制子時(shí)可見CD46蛋白質(zhì)表達(dá)水平上調(diào)。這一結(jié)果表明CD46是miR-520b和miR-520e兩者共同的靶基因。同時(shí)也提示miR-520b和miR-520e可能是通過結(jié)合CD463’非翻譯區(qū)(3’UTR)抑制其翻譯調(diào)控CD46蛋白質(zhì)表達(dá)。為了進(jìn)一步證明這個(gè)假設(shè),我們克隆了CD463’UTR miR-520b和miR-520e結(jié)合區(qū)并構(gòu)建了報(bào)告基因載體。報(bào)告基因結(jié)果表明miR-520b和miR-5

9、20e可以直接靶向結(jié)合CD463’UTR相應(yīng)的結(jié)合區(qū)。ELISA結(jié)果表明,在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-520b或miR-520e可以增加補(bǔ)體成分C3b在腫瘤細(xì)胞上的積累,從而激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑,促進(jìn)CDC對(duì)腫瘤細(xì)胞的裂解作用。以上研究闡明乳腺癌細(xì)胞中miR-520b和miR-520e均可直接靶向CD46影響補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。
　　 2.miR-520b靶向HBXIP影響補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用及其分子機(jī)制研究
　　 我

10、們前期發(fā)現(xiàn)HBXIP在腫瘤細(xì)胞中促進(jìn)增殖、抑制凋亡等方面發(fā)揮重要作用。本研究中我們探討了HBXIP在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)CDC的作用。我們首先檢測(cè)了HBL-100,MCF-7,LM-MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中HBXIP的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)三株乳腺癌細(xì)胞系HBXIP的表達(dá)水平均高于HBL-100細(xì)胞系,并發(fā)現(xiàn)HBXIP的表達(dá)水平與膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(mCRPs)的主要成員CD46,CD55和CD59的表達(dá)水平呈正相關(guān)。因此,我們?cè)O(shè)想H

11、BXIP可能與調(diào)節(jié)CD46,CD55和CD59有關(guān)。
　　 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,在過表達(dá)HBXIP基因的乳腺癌細(xì)胞系中,CD46,CD59報(bào)告基因活性升高,而RNA干擾HBXIP基因后其報(bào)告基因活性降低。應(yīng)用Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HBXIP可以上調(diào)CD46,CD55和CD59的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,而在干擾的乳腺癌細(xì)胞系CD46,CD55和CD59的mRNA水平下調(diào)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系中瞬時(shí)過表達(dá)或

12、干擾HBXIP可以以劑量依賴的方式上調(diào)或下調(diào)mCRPs的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。以上結(jié)果表明HBXIP在乳腺癌細(xì)胞中可以調(diào)節(jié)CD46,CD55和CD59的表達(dá)。
　　 為了進(jìn)一步闡明HBXIP調(diào)節(jié)mCRPs的分子機(jī)制,我們通過報(bào)告基因、Western blot分析、免疫熒光染色方法發(fā)現(xiàn)HBXIP在乳腺癌細(xì)胞中可以激活NF-κB。雙熒光素酶報(bào)告基因以及Western blot分析表明,用NF-κB特異性抑制劑PDTC處理MCF-7-HBX

13、IP乳腺癌細(xì)胞后可拮抗CD46,CD55和CD59的表達(dá),當(dāng)RNA干擾NF-κB活性時(shí)也可獲得相似的結(jié)果。上述結(jié)果表明HBXIP可以上調(diào)CD46,CD55和CD59可以通過NF-κB信號(hào)通路。我們還發(fā)現(xiàn)HBXIP也可以上調(diào)ERK1/2的磷酸化水平,而對(duì)絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)其他兩個(gè)成員p38和c-Jun N末端激酶(JNK)的磷酸化水平無影響。發(fā)現(xiàn)磷酸化的ERK1/2也可以上調(diào)CD46,CD55和CD59的表達(dá)水平。ERK1/2

14、上游激酶MEK1的特異性抑制劑PD98059也可有效抑制mCRPs的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。進(jìn)一步通過Western blot、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)研究表明,ERK1/2的活化可以促進(jìn)NF-κB的活性,并使其入核,進(jìn)而促進(jìn)mCRPs的表達(dá)。上述結(jié)果表明,HBXIP可以通過ERK1/2/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)CD46,CD55和CD59的表達(dá)水平,進(jìn)而降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)CDC作用的敏感性,發(fā)揮乳腺癌細(xì)胞的免疫逃逸作用。

15、r>　　 為了探討HBXIP上游調(diào)控因子,我們通過TargetScan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HBXIP為miR-520b的靶基因。于是,我們克隆并且構(gòu)建了含有HBXIP3’UTR的報(bào)告基因載體,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及 Western blot分析結(jié)果表明miR-520b可以直接結(jié)合HBXIP3’UTR從而抑制HBXIP蛋白質(zhì)的翻譯。表明HBXIP在參與調(diào)節(jié)CDC作用中可以被miR-520b調(diào)控。
　　 綜上所述,本研究通過在乳腺癌細(xì)

16、胞中對(duì)miR-520b或miR-520e的深入研究,發(fā)現(xiàn)miR-520b或miR-520e在乳腺癌免疫抑制方面發(fā)揮重要的作用,主要闡明了如下分子機(jī)制:1)miR-520b或miR-520e通過直接靶向結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46,影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體攻擊的效應(yīng)；2)miR-520b靶蛋白HBXIP可以通過ERK1/2/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)CD46,CD55和CD59的表達(dá)水平,進(jìn)而降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)CDC作用的敏感性,發(fā)揮乳腺癌細(xì)胞的免