姜黃素對肺癌細胞增殖、凋亡、促血管生成和放射敏感性的作用及其機制的體外研究.pdf

1、肺癌是世界上發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤之一，人們試圖從中藥有效成分中尋找一種高效、低毒，能抑制腫瘤細胞增殖誘導其凋亡且對放射具有增敏作用的藥物，從而為肺癌的臨床治療提供一種新途徑。 姜黃素(Curcumin，Cur)是從姜科姜黃屬植物姜黃(curcumalonga)根莖中提取的一種酚類色素，大量研究表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學功能，且價格低廉，毒性很低，目前對其抗腫瘤作用的研究主要集中在腫瘤的化學預防方面。

2、 一、姜黃素抑制人肺癌細胞(A2)生長、誘導凋亡的作用及其機制 (一)實驗方法: 1、細胞培養(yǎng)。 2、MTT法藥物敏感試驗消化細胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，分別加入含不同濃度姜黃素的RPMI1640培養(yǎng)液100μ1，培養(yǎng)48h后，每孔加入5mg/mlMTT20μl，用酶標儀檢測OD值，檢測波長為490nm。 3、Annexin-FITC標記法定量檢測細胞凋亡收集細胞，清洗，離心，加入結合b

3、uffer，重懸細胞。 4、細胞凋亡的形態(tài)學檢測細胞經2.5％戊二醛、1％鋨酸雙固定，梯度乙醇和丙酮脫水，Epon812樹脂包埋超薄切片機(AO型)切片，醋酸鈉和檸檬酸鉛雙重染色，JEM-1200EX和H-600型透射電鏡下觀察并拍照。 5、細胞總DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳收集細胞，重懸，離心，去上清，重復一次。 6、Westem blot檢測A2細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、P53、survivin、F

4、as收集細胞，裂解，測蛋白濃度，定蛋白，10％SDS-PAGE電泳，轉印，TBS封閉，轉到Bcl-2、Bax、P53、Fas及survivin一抗4℃，過夜。 (二)結果: 1、MTT法藥物敏感試驗姜黃素對A2細胞的抑制作用呈濃度依賴性，計算48小時的IC50值為40μmol/L。 2、細胞凋亡的形態(tài)學檢測透射電鏡下觀察，對照組A2細胞中細胞核及線粒體、內質網等結構清晰，核占細胞體積的大部分。 3、Ann

5、exin-FITC標記法定量檢測細胞凋亡分別收集姜黃素40μmol/L 作用24小時、48小時、72小時及正常對照組的細胞進行Annexin V-FITC標記結合流式細胞儀檢測細胞凋亡。 4、DNA瓊脂糖凝膠電泳分別收集姜黃素40μmol/L作用24小時、48小時、72小時及正常對照組的細胞進行DNA瓊脂糖電泳。 5、Westem blotting分別收集姜黃素40μmol/L作用6小時、12小時、24小時、48小時及正

6、常對照組的細胞，提取總蛋白，檢測凋亡相關蛋白的表達，發(fā)現隨時間的延長，Bax、P53、Fas蛋白表達水平逐漸升高。而Bcl-2、survivin蛋白表達水平逐漸降低。 總之：姜黃素誘導肺癌細胞株A2細胞凋亡是多靶點，多途徑的，其與凋亡相關基因的改變、細胞因子的分泌等密切相關。 二、姜黃素對血管生成的作用及其機制的研究 (一)實驗方法: 1、細胞培養(yǎng)用含10％56℃滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37

7、℃飽和濕度、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，HUVEC、A2細胞呈單層貼壁生長，實驗取對數生長期細胞。 2、MTT法觀察姜黃素對HUVECs增殖的影響細胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，分別加入含不同濃度姜黃素的RPMI1640培養(yǎng)液。 3、Annexin-FITC標記法定量檢測細胞凋亡消化收集細胞，加入結合buffer，重懸細胞，調整細胞數。 4、逆轉錄PCR檢測血管生成素1和血管生成素2(Ang-1、Ang-2)

8、和血小板反應素(TSP)的mRNA水平細胞總RNA提取，采用紫外光譜掃描儀檢測總RNA純度；逆轉錄；PCR產物分析：取PCR產物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結果以Ang-1、Ang-2和TSP分別與β-actin條帶的吸光度比值表示Ang-1、Ang-2和TSP的mRNA的相對表達強度。 5、Western blot檢測VEGF、MMP-9蛋白的表達收集細胞，裂解，測蛋白濃度，定蛋白，10％SDS-PAGE電泳，轉印，TBS封閉

9、，轉到VEGF、MMP-9一抗4℃，過夜。 (二)結果 1、姜黃素處理HUVEC細胞后MTT法檢測結果姜黃素對HUVEC細胞增殖抑制作用呈量效關系：不同濃度姜黃素對培養(yǎng)的人血管內皮細胞的增殖有顯著抑制作用。隨著姜黃素濃度的增加，作用時間的延長，其抑制作用增強。 2、姜黃素對HUVECs凋亡的影響流式細胞術檢測不同濃度姜黃素對HUVECs凋亡的影響。 2、RT-PCR分別收集姜黃素40μmol/L 作用6小

10、時、12小時、24小時、48小時及正常對照組的細胞，提取RNA，檢測血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)及血小板反應素(TSP)的mRNA的表達，可見隨姜黃素作用時間的延長Ang-1、Ang-2mRNA的表達明顯低于對照組；TSP的mRNA的表達高于對照組。 4、Westem blotting分別收集姜黃素40μmol/L 作用6小時、12小時、24小時、48小時及正常對照組的細胞，提取總蛋白，檢測VEGF

11、及MMP9蛋白的表達顯著低于對照組。 總之，姜黃素可能通過多種信號途徑抑制血管生成：①降低腫瘤細胞血管生成因子(VEGF， Ang-1，Ang-2)和(或)提高抑制因子(TSP-1)的表達水平來調控血管生成因子的平衡，抑制血管生成的表型轉換。②抑制血管內皮細胞的增殖，促進內皮細胞的凋亡。③減少基質金屬蛋白酶(MMP-9)的表達從而抑制基底膜及細胞外基質的降解。 三、姜黃素對人肺癌(A2)細胞放療增敏的體外實驗研究

12、 (一)實驗方法: 1、集落形成試驗接種細胞于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時后更換含不同濃度的姜黃素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時和48小時后，在室溫下用Cs放射源照射，照射后用藥組更換為不含藥物的培養(yǎng)液與單純照射組一起繼續(xù)培養(yǎng)9天。9天后細胞用95％乙醇固定，姬母薩染色，≥50個細胞記數為一個存活集落，對每個測量點實驗均重復三次。 3、細胞凋亡檢測細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，設空白對照(即單純放射組)，實驗組(即藥物加放射組)不同濃度的姜

13、黃素，培養(yǎng)24h接受2、4、6、8Gy照射后，繼續(xù)培養(yǎng)24h，取100μl細胞懸液，加入DNA-PREPTMLPR 200μl混勻，30s后加入DNA-PREP-TM染色劑(PI染色)2ml混勻。流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。 4、蛋白免疫印跡法(Westem-blot)檢測周期調控因子及NF-kB蛋白水平的表達收集細胞，裂解，測蛋白濃度，定蛋白，樣品加入樣品緩沖液，10％SDS-PAGE電泳，轉印，TBS封閉，封閉后TTBS洗2

14、次，每次5分鐘，轉到cyclinBl、P34<'cdc2>、phos-P34<'cdc2>、P21、survivin及NF-kB一抗4℃，過夜。 (二)結果: 1、細胞周期檢測血清饑餓法同步在GO期的細胞，棄無血清RPMI1640培養(yǎng)基，加入含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 2、細胞周期阻滯取血清饑餓法同步在GO期細胞，經2小時恢復期后，分別向實驗組的3瓶細胞每瓶中加入姜黃素40μmol/L。再取

15、恢復期后18小時的3瓶細胞，每瓶細胞中加入姜黃素，使終濃度為40μmol/L。每3小時收集一瓶細胞，進行流式細胞儀檢測。各時間均可見凋亡標志的亞二倍體峰。 3、不同處理因素對A2細胞凋亡的影響單純放射組和藥物加放射組分別處理A2細胞后，藥物加放射組及單純放射組均在G0+G1峰之前出現一個明顯的亞二倍體峰(凋亡峰)，但以藥物加放射組更為明顯。 4、Westem blotting取同步化恢復期后18小時的細胞，加入姜黃素使終

16、濃度為10μmol/L。作用3小時，再分別收集恢復期后18小時、21小時的細胞，檢測蛋白印跡，在姜黃素處理3小時后，P34、phos-P34表達量沒有改變，cyclinB、survivin及NF-kB蛋白表達量減少，P21蛋白表達量增加。 總之，姜黃素能增加肺癌細胞的放射敏感性，其機制可能為使A2細胞發(fā)生G2/M期阻滯，及抑制NF-kB蛋白的表達；細胞發(fā)生周期阻滯與cyclinB、survivin蛋白表達量減少，P21蛋白表達量

17、增加有關。 結論: 1、姜黃素能誘導A2細胞凋亡，凋亡發(fā)生可能與c-myc、bcl-2、survivin蛋白表達下降；而bax、fas、p53、Caspase-3的蛋白表達升高相關。 2、姜黃素能抑制腫瘤血管生成其作用通過(1)降低腫瘤細胞血管生成因子(VEGF，Ang-1，Ang-2)和(或)提高抑制因子(TSP-1)的表達水平來調控血管生成因子的平衡，抑制血管生成的表型轉換。(2)抑制血管內皮細胞的增殖，促進