超聲作用下脂肪酶催化豆油水解反應(yīng)的研究.pdf

1、當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的高溫高壓油脂水解技術(shù)及傳統(tǒng)的中壓催化水解技術(shù)存在著副反應(yīng)嚴(yán)重和污染環(huán)境等不可避免的缺陷，而超聲波和酶催化技術(shù)都具有投資低、條件溫和、耗能低、副反應(yīng)少、環(huán)境友好等特點(diǎn)，本文結(jié)合兩者的優(yōu)勢潛質(zhì)，對超聲波—脂肪酶協(xié)同催化油脂水解反應(yīng)進(jìn)行了研究。 選擇具有安全無毒，成本低，可提高底物及產(chǎn)物體積濃度，產(chǎn)物分離純化步驟少等優(yōu)點(diǎn)的無溶劑體系，對常規(guī)恒溫振蕩水浴方式下的C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解的反應(yīng)進(jìn)行了研究

2、。得到C.lipolytica的反應(yīng)特性為：最佳反應(yīng)溫度在45℃附近；該酶為堿性脂肪酶，從pH6.1—8.3范圍內(nèi)酶活力呈波浪式變化；當(dāng)C.lipolytica濃度超過1％(w/w)時，出現(xiàn)明顯的酶濃度抑制現(xiàn)象；水油比超過0.675：1(w/w)后，反應(yīng)速率的變化趨于平衡。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面分析，建立了能夠反映各條件因素對反應(yīng)進(jìn)程影響程度的數(shù)學(xué)模型，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行的方差分析和典型分析結(jié)果顯示：溫度、加酶量對水解反應(yīng)影響高度顯著，而緩

3、沖溶液pH、水油比在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對反應(yīng)的影響不顯著。C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)條件為：溫度42.2℃、pH7.51、加酶量0.85％(w/w)、水油比1.24(w/w)。 超聲反應(yīng)中，超聲功率的大小是酶催化反應(yīng)非常重要的影響因素，在本文所研究的功率范圍內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)酶失活現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著超聲強(qiáng)度的增加水解反應(yīng)速率增大，當(dāng)超聲強(qiáng)度超過1.20W/c㎡時，反應(yīng)速率隨功率的增加變化緩慢，但是通過精密度實(shí)驗(yàn)

4、發(fā)現(xiàn)隨著超聲強(qiáng)度的增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性得到了提高，說明在較低超聲強(qiáng)度下，輸出功率的波動對反應(yīng)速率的影響較大，綜合考慮后選擇了1.64W/c㎡的超聲波進(jìn)行后續(xù)研究。 研究了超聲波對C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解反應(yīng)的影響作用，通過與振蕩水浴方式下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對比發(fā)現(xiàn)超聲波使C.lipolytica的耐熱性有了5℃左右的提高；可以避免或是減少酶在油水界面的聚集，沒有出現(xiàn)酶濃度抑制反應(yīng)現(xiàn)象；在超聲反應(yīng)中，水變得更加“有效”，

5、即水解反應(yīng)按照假單底物規(guī)律進(jìn)行時水的濃度臨界值較低；而pH的變化規(guī)律與振蕩水浴中一致，表明超聲作用沒有改變該酶的離子化反應(yīng)狀態(tài)。對超聲作用下的C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解反應(yīng)進(jìn)行了響應(yīng)面分析，建立了能夠反映各條件因素對反應(yīng)進(jìn)程影響程度的數(shù)學(xué)模型，并得到超聲作用下的最優(yōu)反應(yīng)條件為：溫度47.0℃、pH7.77、加酶量0.77％(w/w)、水油比0.71(w/w)。 復(fù)合酶反應(yīng)是通過兩種或多種酶的協(xié)同作用，使其催化能力

6、得到明顯提高的一種酶反應(yīng)技術(shù)。本文對Sigma-3126，生工PPL，CLL，Novo435和Amano—G五種不同來源的脂肪酶進(jìn)行了篩選和復(fù)配，得到了水解效果較好的CLL和Amano—G組合。對各種反應(yīng)條件進(jìn)行了研究，確定最優(yōu)工藝條件為：CLL和Amano—G的加入量分別為1％(w/w)和0.1％(w/w)；在CLL反應(yīng)進(jìn)行1h后加入Amano—G；反應(yīng)溫度45℃；去離子水直接加入反應(yīng)體系作為水相，水油比1:1(w/w)。在此條件下，

7、超聲波對反應(yīng)有一定的促進(jìn)作用，在反應(yīng)開始階段其作用尤為明顯，24h的豆油水解率可以由常規(guī)振蕩水浴中的45.7％提高到94.2％。 酶催化反應(yīng)動力學(xué)是了解酶作用機(jī)理的重要途徑之一，動力學(xué)模型能夠比較準(zhǔn)確的反映某個酶反應(yīng)系統(tǒng)中的各種相互作用對反應(yīng)的影響程度。目前大多數(shù)脂肪酶油脂水解反應(yīng)模型都是假設(shè)油水兩相的界面面積為常數(shù)，這樣的假設(shè)在無溶劑體系中是不恰當(dāng)?shù)?。本文在建立了有效底物濃度模型的基礎(chǔ)上，將有效底物濃度和油水界面面積的變化相結(jié)

8、合，建立了一個新的動力學(xué)模型。 對所建立模型的適用范圍應(yīng)用亞甲基藍(lán)染色—顯微鏡法進(jìn)行了驗(yàn)證，證明該模型在油相體積分?jǐn)?shù)，從0.1—0.9范圍內(nèi)適用；應(yīng)用TLC掃描分析法證明有效底物濃度模型的假設(shè)條件在F=0.1—0.9范圍內(nèi)可靠。并將所得動力學(xué)模型應(yīng)用于C.lipolytica脂肪酶催化的豆油水解反應(yīng)中，在求得反應(yīng)初速度和Sauter直徑隨F變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，應(yīng)用非線性回歸擬合技術(shù)分別求出了振蕩水浴和超聲作用下模型參數(shù)的具體數(shù)值。

9、分別討論了動力學(xué)參數(shù)Ke、k*cal和kd/kp對反應(yīng)速率的影響作用，并結(jié)合具體反應(yīng)對參數(shù)的實(shí)際物理意義進(jìn)行了解釋與分析。 應(yīng)用所建立的有效底物濃度模型，對底物抑制現(xiàn)象給出了合理的解釋，指出實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的底物抑制現(xiàn)象只是“表觀”底物濃度抑制，反應(yīng)速率實(shí)際是由有效底物濃度所控制，超聲波能夠減小底物抑制，加快反應(yīng)進(jìn)行，其根本原因是由于超聲波對有效底物濃度的影響而引起的。 熱力學(xué)研究可以避免體系結(jié)構(gòu)和過程機(jī)理所造成的局限，有利于

10、對反應(yīng)的宏觀特征進(jìn)行分析。本文對熱力學(xué)公式進(jìn)行了推導(dǎo)，測得了C.lipolytica脂肪酶催化豆油水解反應(yīng)在200rpm振蕩水浴和240V超聲功率條件下的反應(yīng)活化能Ea分別為10.33kJ/mol和10.24kJ/mol；指前因子A分別為2.85和3.35。并以45℃下的反應(yīng)為例，計算并討論了熱力學(xué)常數(shù)△≠H、△≠G和△≠S在振蕩水浴和超聲作用下的變化情況。 在綜合前人的研究成果和本論文的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對超聲促進(jìn)C.lipolyt