脂多糖致大鼠急性肺損傷早期Ⅰ型前膠原羧基端肽及轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá).pdf

1、前言：急性肺損傷(ALI)被認(rèn)為是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的早期表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，臨床預(yù)后較差，死亡率較高。ALI發(fā)展過程中肺纖維增生可以通過增加呼吸膜的厚度進(jìn)而影響早期氣血交換，減小肺順應(yīng)性，影響預(yù)后。以往認(rèn)為肺纖維化僅僅發(fā)生在ALL/ARDS的晚期，而近年研究表明在ALL/ARDS早期即有肺纖維增生改變。Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICP)是膠原合成過程中的水解產(chǎn)物，可以反映Ⅰ型膠原的合成情況，本實驗通過檢測脂多糖(

2、LPS)致ALI大鼠血清及肺泡灌洗液(BALF)中PICP的含量，來檢測ALL/ARDS早期是否有肺纖維增生的存在；同時測定轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)含量，并研究其是否與膠原合成有相關(guān)關(guān)系。從而為ALI/ARDS早期肺纖維增生的存在及其發(fā)生機(jī)制的研究提供實驗依據(jù)，并為早期抗纖維化治療提供理論依據(jù)。 材料與方法一、材料1.實驗動物：SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄不拘，共27只，體重275g±25g，飼養(yǎng)于潔凈

3、、溫控的動物中心實驗室，以避免肺部感染的發(fā)生，正常進(jìn)食水，源于中國醫(yī)科大學(xué)動物中心。 2.主要試劑：脂多糖LPS：E.coli，內(nèi)毒素055：B5LPS；購于Sigma.Co。大鼠血清及上清液PICP酶聯(lián)免疫吸附試劑盒：美國進(jìn)口分裝；源于大連泛邦生物技術(shù)公司。TGF-β1一抗；SABC免疫組化試劑盒(包括正常血清封閉液，二抗：兔抗大鼠IgG，SABC，復(fù)合消化酶)；DAB顯色劑。源于武漢博士德生物工程有限公司。 3.主要

4、器材：低溫離心機(jī)：Hettich32R，源于德國。顯微圖象分析系統(tǒng)：MetaMorph/DP10/BX41，由UIC/OLYMPUS，US/JP生產(chǎn)。酶標(biāo)儀：芬蘭雷博公司進(jìn)口。 二、實驗方法1.實驗動物的分組及處理：將27只SD大鼠隨機(jī)分成3組：NS對照組、LPS1組、LPS2組，每組9只大鼠。NS對照組氣管內(nèi)滴注生理鹽水1.0ml/kg，LPS1組及LPS2組氣管內(nèi)滴注LPS1.0ml/kg(濃度為100μg/ml)。將滴注L

5、PS的大鼠隨機(jī)分成兩組，其中給藥后觀察12小時取材的為LPS1組，給藥后觀察24小時取材的為LPS2組。 2.肺損傷的評價：肺損傷嚴(yán)重程度可根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判定：(1)測定肺濕重/干重(W/D)比值：是判定肺水腫的主要指標(biāo)。剪取一部分左肺組織稱濕重(W)，然后置于60℃溫箱中，7天后稱干重(D)，求得W/D。(2)BALF的細(xì)胞總、分?jǐn)?shù)及白蛋白測定：右主支氣管進(jìn)行肺泡灌洗，將回收的支氣管肺泡灌洗液(BALF)混合計量，離心后測上清液

6、白蛋白濃度，離心沉淀細(xì)胞利用4℃低溫離心機(jī)將細(xì)胞均勻平鋪于載波片上，HE染色后在40×高倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計數(shù)。(3)觀察肺組織病理表現(xiàn)：取右肺置于10％甲醛溶液中固定12小時，制成蠟塊后制成8μm肺組織切片，用于Hematoxylin-eosin(HE)染色，觀察肺組織病理表現(xiàn)。 3.血清及肺泡灌洗液PICP濃度測定：PICP采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，根據(jù)血清樣品的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

7、 4.TGFβ-1在肺組織中的表達(dá)TGFβ-1采用免疫組化法測定。切片厚4μm，用復(fù)合消化酶進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加一抗稀釋濃度為1：100，20-37℃孵浴2小時，同時以PBS代替一抗而其它條件相同做陰性對照。TGFβ1陽性判定：陽性細(xì)胞的胞膜或胞漿呈棕黃或棕黃色顆粒，每張切片取任意5個視野(×400)，采用顯微圖像分析系統(tǒng)分析每個視野圖像的光密度總值(OD)，求其平均值，根據(jù)該值的高低判定TGFβ1陽性率的高低，OD值越高，TGFβ1陽

8、性率越高。 三、統(tǒng)計學(xué)分析：結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示；采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有顯著性。 結(jié)果一、LPS致大鼠ALI評價1.肺組織的病理改變①NS對照組：肺組織大體無異常所見。光鏡可見肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病變。 ②LPS1組和LPS2組大體觀可見所有肺組織均有腫脹，背膜光亮，有部分可見被膜下出血點。光鏡可見肺內(nèi)彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主，肺

9、泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞滲出，有局限性肺氣腫和肺不張，肺毛細(xì)血管擴(kuò)張呈不規(guī)則形，LPS2組較LPS1組肺泡間隔明顯增厚，間質(zhì)增生，有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞浸潤更為明顯。 2.血清白蛋白及總蛋白、BALF中白蛋白含量；BALF的細(xì)胞計數(shù)對照組及各實驗組間血清白蛋白及總蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；BALF中白蛋白在損傷12小時濃度(1.119±0.029g/L)明顯高于對照組(0.306±0.019g/L)；在24小時濃度(

10、0.734±0.033g/L)有所降低，但仍高于對照組；三組間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在BALF的細(xì)胞計數(shù)中，NS對照組以淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞為主，而LPS1組、LPS2組均以中性粒細(xì)胞為主。 3.肺組織濕重/干重(W/D)肺W/D表明：肺損傷12小時組動物(6.517±0.177)與對照組(4.660±0.213)相比W/D明顯升高(P＜0.05)，而24小時組(4.801±0.199)與對照組無差異(P＞0.0

11、5)，說明損傷12小時組肺水腫最明顯。 二、血清及BALF中PICP濃度血清及BALF中PICP濃度在損傷12小時(分別為13.959±4.304μg/L，6.920±2.502μg/L)與對照組(分別為12.380±3.590μg/L，6.899±1.986μg/L)比較無差異(P＞0.05)，而在損傷24小時其濃度(分別為64.752±11.966μg/L，35.256±3.324μg/L)顯著高于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P

12、＜0.05)。 三、TGF-β1在肺組織中的表達(dá)TGF-β1在肺組織免疫組化染色圖象分析顯示在損傷12小時(45.157±29.443)及24小時組(140.081±21.854)TGF-β1在肺組織中灰度總值(A)明顯高于正常對照組(7.175±3.686)(P＜0.05)；在損傷24小時組TGF-β1在肺組織中灰度總值(A)明顯高于損傷12小時組(P＜0.05)。NS對照組TGFβ1在肺組織表達(dá)陰性；LPS1組TGFβ1在肺

13、泡巨噬細(xì)胞、氣道壁大量表達(dá)；LPS2組TGFβ1在肺泡巨噬細(xì)胞、氣道壁表達(dá)進(jìn)一步增加。 四、血清及BALF中PICP濃度與肺組織TGF-β1表達(dá)相關(guān)分析1.在急性肺損傷24小時血清和BALF中PICP濃度與肺組織TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)。兩者的相關(guān)系數(shù)分別為R=0.838，R=0.801(自由度n'=7，P＜0.01)。 討論急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和急性肺損傷(ALI)是以頑固性低氧血癥，呼吸頻數(shù)和呼吸窘迫為主要

14、表現(xiàn)的臨床綜合征，肺纖維化是直接或間接導(dǎo)致ALI/ARDS患者死亡的原因之一。ARDS的病理過程可以分為三個階段：滲出期、增生期、和纖維化期。以往認(rèn)為纖維增生反應(yīng)只發(fā)生在增生晚期及纖維化期。本研究結(jié)果顯示：LPS致大鼠ALI24小時血清及BALF中PICP濃度顯著增高，肺組織TGF-β1表達(dá)顯著增高，說明ALI/ARDS的早期有肺纖維化形成的傾向。 膠原合成是肺纖維增生的重要標(biāo)志。膠原蛋白的合成過程中首先合成前膠原；前膠原的肽鏈

15、兩端均有一個附加肽，在細(xì)胞外液中內(nèi)切酶作用下去除氨基及羧基端附加肽，生成膠原纖維，同時釋放可溶性的N-末端及C-末端前膠原肽。因此，測定可溶性N-末端及C末端前膠原肽，可以作為膠原合成的標(biāo)志物。PICP為Ⅰ型前膠原羧基端肽。可以反映Ⅰ型膠原的合成情況。本實驗檢測了LPS致大鼠急性肺損傷不同時段血清及BALF中PICP的濃度，其結(jié)果顯示在LPS致大鼠急性肺損傷12小時組血清及BALF中PICP濃度無顯著增高，而在損傷24小時PICP濃度顯

16、著高于正常對照組，肺組織病理結(jié)果顯示24小時肺組織損傷程度比12小時肺損傷程度嚴(yán)重，說明：前膠原肽主要來自損傷的肺組織，損傷愈重PICP濃度增加愈明顯。這與ChesnuttAN、MarshallRP等學(xué)者研究結(jié)果相一致。 在近年肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究中，TGF-β1被認(rèn)為是與肺纖維化形成密切相關(guān)的細(xì)胞因子之一。TGF-β1可以通過趨化成纖維細(xì)胞并刺激其生長和成熟，刺激成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，如纖維連接蛋白、膠原和蛋白

17、多糖的表達(dá)等機(jī)制促進(jìn)肺纖維化。近來研究發(fā)現(xiàn)，在肺損傷24小時內(nèi)TGF-β1在誘導(dǎo)膠原基因表達(dá)方面扮演重要角色。本實驗研究表明，在肺損傷12小時及24小時TGF-β1均顯著高于對照組；TGF-β1表達(dá)與血清及BALF中PICP濃度在肺損傷24小時二者具有正相關(guān)性，提示TGF-β1可能是膠原增生的誘導(dǎo)劑，肺損傷早期在誘導(dǎo)膠原基因表達(dá)方面可能扮演著重要的角色。 結(jié)論1.LPS致大鼠ALI后24小時血清及BALF中PICP濃度顯著增高提