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文檔簡介
1、第一章 DDAH/ADMA在膠原誘發(fā)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用及機制
研究背景:
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是最常見的慢性炎癥性的自身免疫系統(tǒng)疾病,但其發(fā)病機制尚未完全闡明。
非對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是內(nèi)源性一氧化氮合酶的抑制物,除抑制一氧化氮的生成外,還是一種前致炎因子。二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylargininedimethylaminohyd
2、rolase,DDAH)是ADMA的代謝酶。臨床研究發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血漿中ADMA水平顯著升高,且與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特異性診斷抗體抗瓜氨酸化蛋白抗體呈顯著正相關(guān),這提示DDAH/ADMA途徑可能參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)過程。
皮質(zhì)抑素(cortistatin,CST)是新的生長抑素家族成員,具有調(diào)節(jié)免疫與抗炎作用,是目前研究最多的生長抑素家族成員。研究發(fā)現(xiàn),CST能顯著抑制TNF-α生成,并減輕膠原所致關(guān)節(jié)腫脹和軟骨破壞。
3、本實驗將在膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型和原代培養(yǎng)的大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞,研究DDAH/ADMA在膠原誘發(fā)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用,并探討DDAH/ADMA的效應(yīng)是否涉及CST途徑。
方法:
采用膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分與關(guān)節(jié)周徑及病理評分(蘇木精-伊紅染色法)以評價組織損傷。收集大鼠血漿用以檢測ADMA與炎性因子水平;分離膝關(guān)節(jié)滑膜與右后踝關(guān)節(jié)用以檢測滑膜組織炎性因子及DDAH與CST的表達(dá)。膠原酶消化法分
4、離大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞,原代培養(yǎng),分別收集細(xì)胞與細(xì)胞上清液。酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿與細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β及IL-6水平,高效液相色譜檢測血漿與細(xì)胞上清液ADMA水平。熒光實時定量PCR檢測滑膜與細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、DDAH-1、DDAH-2及CST mRNA表達(dá)。免疫組織化學(xué)法檢測滑膜DDAH-2與CST蛋白表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞DDAH-1與DDAH-2蛋白表達(dá)。免疫細(xì)胞熒光法檢測細(xì)胞CST表達(dá)。利用
5、GV230工具載體建立過表達(dá)DDAH-2與過表達(dá)CST的原代大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞,以分析DDAH-2與CST的相互作用關(guān)系。
結(jié)果:
膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠較正常大鼠關(guān)節(jié)紅腫變形,關(guān)節(jié)炎指數(shù)及病理評分顯著高于正常對照組,軟骨及骨質(zhì)破環(huán),血漿和滑膜組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均顯著升高,滑膜組織DDAH-2表達(dá)顯著下調(diào),而滑膜組織DDAH-1表達(dá)和血漿ADMA水平則沒有明顯變化。CST在膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠
6、滑膜組織中的表達(dá)也顯著下調(diào)。在原代培養(yǎng)的大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞,TNF-α可時間依賴性升高細(xì)胞IL-1β、IL-6及ADMA水平并降低DDAH-2與CST表達(dá),但對DDAH-1表達(dá)無明顯作用。外源性ADMA處理也可時間與劑量依賴性促進(jìn)大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6,并下調(diào)CST表達(dá)。過表達(dá)DDAH-2能顯著抑制TNF-α促IL-1β、IL-6分泌與下調(diào)CST表達(dá)的作用。過表達(dá)CST也可以顯著抑制TNF-α促IL-1β、IL-
7、6分泌的作用,但不影響ADMA水平與DDAH-2表達(dá)。
結(jié)論:
DDAH/ADMA途徑在膠原誘發(fā)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)中起重要作用;參與炎癥反應(yīng)的DDAH亞型為DDAH-2而非DDAH-1;DDAH/ADMA的效應(yīng)與上調(diào)抗炎因子CST表達(dá)有關(guān)。
第二章白藜蘆醇甲基化衍生物BTM-0512抑制膠原誘發(fā)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)及機制
研究背景:
白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物,具有抗炎,抗氧
8、化等多種藥理活性。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能減輕膠原所致關(guān)節(jié)腫脹和骨質(zhì)破壞,但其機制尚未完全明了。
(E)-3,5,4'-三甲氧基-1,2-二苯乙烯((E)-3,5,4'-trimethoxystilbene,BTM-0512)為白藜蘆醇甲基化衍生物,其穩(wěn)定性,脂溶性及生物利用度均優(yōu)于白藜蘆醇。文獻(xiàn)報道BTM-0512對手術(shù)誘發(fā)的骨關(guān)節(jié)炎具有顯著治療作用,但其機制也未闡明。
基于我們第一部分研究證明膠原誘發(fā)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的
9、病理過程涉及DDAH/ADMA/CST途徑,以及白藜蘆醇和BTM-012能上調(diào)DDAH表達(dá),降低ADMA水平。本研究將在膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型和原代培養(yǎng)的大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞,探討B(tài)TM-0512抑制膠原誘發(fā)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的作用及其機制是否涉及DDAH/ADMA/CST途徑。
方法:
建立膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。造模成功后分別給予生理鹽水、溶媒(羧甲基纖維素鈉)、BTM-0512低/高劑量(20或60 m
10、g/kg·d)、白藜蘆醇(60 mg/kg·d)及來氟米特(免疫抑制劑)(6 mg/kg·d)。分別給藥處理30天后,以關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分與關(guān)節(jié)周徑及病理評分(蘇木精-伊紅染色法)評價組織損傷。收集大鼠血漿用以檢測ADMA與炎性因子水平;分離膝關(guān)節(jié)滑膜與右后踝關(guān)節(jié)用以檢測滑膜組織炎性因子及DDAH與CST的表達(dá)。膠原酶消化法分離大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞,原代培養(yǎng),分別收集細(xì)胞與細(xì)胞上清液。酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿與細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β
11、及IL-6水平,高效液相色譜檢測血漿與細(xì)胞上清液ADMA水平。熒光實時定量PCR檢測滑膜與細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、DDAH-1、DDAH-2及CST mRNA表達(dá)。免疫組織化學(xué)法法檢測滑膜DDAH-2與CST蛋白表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞DDAH-1與DDAH-2蛋白表達(dá)。免疫細(xì)胞熒光法檢測細(xì)胞CST表達(dá)。利用siRNA干擾片段建立DDAH-2基因沉默與CST基因沉默的原代大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞,以分析BTM-0512的作用
12、機制。
結(jié)果:
膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠較正常大鼠關(guān)節(jié)紅腫變形,關(guān)節(jié)炎指數(shù)及病理評分顯著高于正常對照組,軟骨及骨質(zhì)破環(huán),血漿和滑膜組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均顯著升高,滑膜組織DDAH-2的表達(dá)顯著下調(diào),而滑膜組織DDAH-1表達(dá)和血漿ADMA水平則沒有明顯變化,滑膜組織CST表達(dá)顯著下調(diào)。BTM-0512可劑量依賴性抑制膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹和病理改變,降低血漿和滑膜TNF-α、IL-1β及IL-
13、6水平,上調(diào)DDAH-2與CST mRNA與蛋白表達(dá)。在原代培養(yǎng)的大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞,BTM-0512能顯著抑制TNF-α促IL-1β、IL-6及ADMA分泌,并減弱TNF-α下調(diào)DDAH-2與CST表達(dá)的作用,但對DDAH-1表達(dá)無明顯作用;BTM-0512也能顯著抑制 ADMA促IL-1β、IL-6分泌并下調(diào)CST表達(dá)的作用。DDAH-2基因沉默顯著降低BTM-0512對TNF-α所致大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。CST基因
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