線粒體12S rRNAA1555G突變家系的篩查及tRNAThrT15943C突變與耳聾的相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　1.對收集到的非綜合征型耳聾(nonsyndromic hearing loss，NSHL)病例進(jìn)行線粒體12S rRNA基因突變篩查，統(tǒng)計(jì)分析線粒體12S rRNA基因突變情況。
　　2.對樣本中篩查到的1例既攜帶線粒體12S rRNA A1555G突變，又?jǐn)y帶tRNAThrT15943C突變的中國漢族耳聾家系進(jìn)行臨床和分子遺傳學(xué)評估，探討tRNAThrT15943C突變對A1555G突變的耳聾的表型表達(dá)的影響

2、。
　　3.構(gòu)建攜帶線粒體tRNAThr T15943C突變的永生化淋巴母細(xì)胞系(lymphoblastoidcell lines，LCLs)，一方面永久保存我國寶貴的聾病資源;另一方面進(jìn)行部分細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，深入研究T15943C突變與耳聾的關(guān)系，為耳聾的診斷及預(yù)防提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1.在患者及其家屬知情同意的情況下，收集溫州醫(yī)科大學(xué)各大合作醫(yī)院耳鼻咽喉科門診及特殊聾校NSHL患者血樣3029份，正常

3、對照血樣512份。
　　2.提取所收集血樣的全基因組DNA，并對線粒體12S rRNA基因進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增、產(chǎn)物純化及測序，運(yùn)用生物信息軟件將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列比對，統(tǒng)計(jì)變異情況。
　　3.對篩查到的所有攜帶線粒體12S rRNAA1555G突變的先證者進(jìn)行線粒體基因組全序列分析，然后依據(jù)東亞線粒體單體型進(jìn)化樹做單體型分析和分類。
　　4.對篩查到的

4、1例同時攜帶線粒體12S rRNA A1555G和tRNAThr T15943C突變的中國漢族耳聾家系WL008家系進(jìn)行詳細(xì)的家系調(diào)查，完善家系成員的臨床資料，從臨床和分子遺傳學(xué)角度進(jìn)行分析評估。
　　5.運(yùn)用EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)轉(zhuǎn)化人外周血B淋巴細(xì)胞(B lymphocytecell，BLC)的方法，構(gòu)建3組單體型相同但攜帶不同突變位點(diǎn)的永生化淋巴母細(xì)胞系。
　　6.利用流式細(xì)胞儀對成功

5、構(gòu)建的LCLs進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平和線粒體膜電位（mitochondridal membrane potential，MMP）檢測，并繪制加半乳糖和葡萄糖后的細(xì)胞倍增時間(doubling time，DT)。
　　7.統(tǒng)計(jì)分析3組LCLs在ROS、MMP和DT等細(xì)胞功能方面的差異性。
　　結(jié)果：
　　1.對采集的全部NSHL患者和正常對照者血樣進(jìn)行線粒體12S

6、rRNA基因突變篩查發(fā)現(xiàn)，共109例NSHL患者攜帶線粒體12S rRNAA1555G突變。
　　2.對這109例攜帶12S rRNAA1555G突變的先證者進(jìn)行線粒體全序列分析，然后結(jié)合單體型進(jìn)化樹分析，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)有2例均為東亞線粒體單體型F，其中1例僅攜帶線粒體12S rRNAA1555G突變（編號:NB079），另1例除了攜帶A1555G突變外，還攜帶tRNAThr T15943C突變（編號:WL008）。
　　3.對既

7、攜帶A1555G突變，又?jǐn)y帶T15943C突變的中國漢族耳聾家系WL008家系進(jìn)行臨床和分子遺傳學(xué)評估，證實(shí)該家系與母系遺傳特征相符，且母系成員的聽力損失程度從正常、重度到極重度不等，聽力圖結(jié)構(gòu)包括平坦型和斜坡型。
　　4.線粒體基因組全序列分析結(jié)果顯示，除了已報(bào)道的A1555G和未報(bào)道的tRNAThrT15943C突變位點(diǎn)，WL008家系先證者還攜帶33個已報(bào)道的多態(tài)性位點(diǎn)，9個位于D-Loop區(qū)，5個位于rRNA，19個位于蛋

8、白編碼區(qū)。其中錯義突變共6個，均位于蛋白編碼區(qū)，其他的均為無義突變。而GJB2基因篩查后未發(fā)現(xiàn)任何致病位點(diǎn)。
　　5.與其他物種線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的種系發(fā)育分析學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)tRNAThrT15943C突變在人類、小鼠、牛和非洲爪蟾的進(jìn)化上是高度保守的，而其他變異位點(diǎn)均不保守。此外，對tRNAThrT15943C突變在16個靈長類物種中進(jìn)行保守性分析，結(jié)果顯示保守性指數(shù)(Conserv

9、ation Index，CI)高達(dá)94％。進(jìn)一步的單體型進(jìn)化樹分析證實(shí)，該家系屬于東亞線粒體單體型F。
　　6.與另一個同為F單體型但未攜帶繼發(fā)突變位點(diǎn)的A1555G耳聾家系NB079家系比較發(fā)現(xiàn)，WL008家系的耳聾外顯率較高。
　　7.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明，WL008家系和NB079家系細(xì)胞的ROS水平均比正常對照組的高，MMP則較正常對照組下降，其中攜帶tRNAThrT15943C突變的WL008家系比不攜帶該突變的NB0

10、79家系ROS水平高1.49％，MMP下降13.53％; DT結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)液中含有半乳糖或葡萄糖時，兩組突變組細(xì)胞的生長速度均比正常對照組下降，且WL008家系細(xì)胞比NB079家系細(xì)胞的生長速度下降更明顯，比NB079家系分別下降20.48％和15.78％。
　　結(jié)論：
　　1.在109例攜帶線粒體12S rRNAA1555G突變的NSHL患者中，僅1例攜帶tRNAThrT15943C突變，且在512例正常對照樣本中均未

11、發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)，推測tRNA ThrT15943C突變可能與耳聾相關(guān)。
　　2.種系發(fā)育分析學(xué)表明，T15943C突變在16個靈長類物種中高度保守，而從tRNAThr二級結(jié)構(gòu)圖可知，15943位點(diǎn)位于T莖結(jié)構(gòu)上，正常情況下，該位置的T堿基與第48位的A堿基會形成高度保守的T-A堿基配對，當(dāng)15943位點(diǎn)發(fā)生T-C突變時，可破壞該堿基配對，從而影響tRNAThr二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，引起線粒體的功能發(fā)生障礙，最終誘發(fā)耳聾。
　　3

12、.WL008家系中母系成員的聽力損失程度和聽力曲線具有差異性，提示核背景對A1555G突變的表型有修飾作用。但在該家系中，未在GJB2基因上發(fā)現(xiàn)致病突變位點(diǎn)，故可排除與耳聾高度相關(guān)的GJB2基因?qū)υ摷蚁礎(chǔ)1555G表型的修飾作用。
　　4.單體型進(jìn)化樹分析顯示，WL008家系和NB079家系均屬于東亞線粒體單體型F，且兩者均攜帶A1555G同質(zhì)性突變，但同時攜帶tRNAThrT15943C突變的WL008家系比不攜帶該突變位點(diǎn)的N

13、B079家系的耳聾外顯率高，提示tRNAThr T15943C突變可能是一個與耳聾相關(guān)的新的繼發(fā)突變位點(diǎn)，與A1555G突變協(xié)同作用，影響耳聾表型的表達(dá)。
　　5.成功構(gòu)建的WL008家系、NB079家系和正常對照組細(xì)胞的部分功能試驗(yàn)初步證實(shí)，當(dāng)個體攜帶線粒體tRNAThrT15943C突變時，導(dǎo)致的細(xì)胞功能異常更顯著。推測可能是由于T15943C突變對細(xì)胞內(nèi)的多種酶的含量或活性產(chǎn)生了影響，造成呼吸復(fù)合體的活性下降，使線粒體的氧化