白楊素聯(lián)合順伯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡作用研究.pdf

1、背景目的及意義:
　　順鉑是常用的腫瘤化療物質(zhì)，順鉑與DNA結(jié)合形成鏈內(nèi)和/或鏈間鏈加合物造成遺傳物質(zhì)的損傷，誘發(fā)一系列信號(hào)蛋白的改變，啟動(dòng)復(fù)雜的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制:如p53活化、p38 MAPKs和/或JNKs活化，NFκ B抑制等。白楊素(chrysin)是在中草藥、蜂蜜及蜂膠中含量豐富的一種黃酮類物質(zhì)，具有多種生物學(xué)功效如抗炎、抗氧化等，近年已有學(xué)者在動(dòng)物試驗(yàn)和體外研究中觀察到白楊素及其衍生物具有一定的腫瘤預(yù)防、抑制腫瘤細(xì)胞

2、生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的潛能。在此，我們研究證明了白楊素與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系(Fig.1)。白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)的腫瘤細(xì)胞死亡是caspase依賴的細(xì)胞凋亡(Fig.2)。這一研究結(jié)果在細(xì)胞和分子水平為白楊素聯(lián)合順鉑的應(yīng)用價(jià)值提供了強(qiáng)有力的支持，更為進(jìn)一步的分子機(jī)制探索提供了平臺(tái)和線索。
　　在體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞中白楊素聯(lián)合順鉑能夠有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。白楊素可以已通過(guò)ERK1/2活化

3、促進(jìn)的p53磷酸化穩(wěn)定p53不被降解，發(fā)揮p53誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的腫瘤抑制蛋白作用，提高順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。盡管距離白楊素真正應(yīng)用到腫瘤臨床治療中還需要對(duì)其抗腫瘤的作用及機(jī)制做更多更深入的研究，但本研究的發(fā)現(xiàn)為白楊素在腫瘤治療中的應(yīng)用又提供了一個(gè)新的證據(jù)。為順鉑聯(lián)合用藥研究探索了一個(gè)可行性更好的方案。
　　目標(biāo):
　　1、在細(xì)胞、分子多水平、多層面探明白楊素聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。
　　2、體外初步探索

4、白楊素聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用的分子機(jī)制，分析白楊素對(duì)p53蛋白及其相關(guān)信號(hào)通路的影響，探索p53蛋白在白楊素聯(lián)合順鉑協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤凋亡作用中的調(diào)控機(jī)制。
　　3、為白楊素聯(lián)合順鉑的抗腫瘤作用研究的體內(nèi)研究提供良好的聯(lián)合用藥方案和理論基礎(chǔ)，為體內(nèi)分子機(jī)制研究提供線索。
　　4、為黃酮類等天然資源在腫瘤治療中的應(yīng)用提供新的思路，為解決順鉑耐藥性和化療的低敏感性問(wèn)題提供可行性更強(qiáng)的治療方案。
　　方法:
　　1、

5、敏感細(xì)胞株的選擇:
　　選擇多種組織來(lái)源的人類腫瘤細(xì)胞系:肝腫瘤細(xì)胞(Hep G2、Hep3B)、結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT-116)、鼻咽癌細(xì)胞(CNE1)等多種細(xì)胞，不同劑量白楊素(5、10、20、40μM)預(yù)處理細(xì)胞2h后再聯(lián)合不同劑量的順鉑(2、5、10μ g/mL)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和存活狀態(tài)，確定單獨(dú)順鉑或白楊素不出現(xiàn)細(xì)胞死亡而聯(lián)合兩種物質(zhì)則出現(xiàn)明顯細(xì)胞死亡增加的細(xì)胞為對(duì)聯(lián)合作用敏感的腫瘤細(xì)胞。
　　2、細(xì)胞

6、死亡和凋亡的定量檢測(cè)分析:
　　倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和密度，拍照記錄細(xì)胞死亡的定量資料;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)亞二倍體峰獲得亞二倍體峰在整個(gè)細(xì)胞周期中的百分比，作為細(xì)胞死亡的定量指標(biāo);熒光核燃料Hoechst33342或DAPI.染色識(shí)別凋亡特異的核固縮確定凋亡細(xì)胞，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，獲得凋亡細(xì)胞定量指標(biāo)。
　　3、研究白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制:
　　以Westem blot免疫印記分析磷酸化和

7、總的p53蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)的變化情況，并以免疫熒光方法分析磷酸化的p53進(jìn)入細(xì)胞核的量進(jìn)行分析，明確轉(zhuǎn)錄因子p53在白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用。
　　4、證明白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)中p53作為轉(zhuǎn)錄因子的作用:
　　以Westem blot免疫印記分析p53調(diào)控的前凋亡蛋白Bax、DR5及p53相關(guān)的凋亡抑制蛋白Bcl-2的變化，外源及內(nèi)源凋亡途徑的啟動(dòng)蛋白caspase-8和caspase-9的活化改

8、變情況，及利用線粒體細(xì)胞質(zhì)分離試劑盒獲得的細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素c量的改變，證明p53在白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)中轉(zhuǎn)錄因子角色。
　　5、白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)中影響p53轉(zhuǎn)錄活性的上游分子事件:
　　按PureLink RNA Mini Kit(Ambion)試劑說(shuō)明數(shù)提取HepG2細(xì)胞總RNA。OneStep RT-PCR分析p53的表達(dá)情況，Western blot免疫印記分析磷酸化和總MDM2和ERK

9、1/2的時(shí)間變化規(guī)律，探索影響p53轉(zhuǎn)錄活性的上游分子變化，并使用ERK1/2抑制劑U0126來(lái)證明ERK1/2的活化對(duì)p53磷酸化的影響。對(duì)白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制做深入探討。
　　6、統(tǒng)計(jì)分析:
　　數(shù)據(jù)采用SPSS13.統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組之間樣本均數(shù)比較以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單樣本t檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較滿足方差齊性以單因素方差分析

10、(one-wayANOVA)進(jìn)行比較，組間兩兩比較采用LSD's法;若方差不齊，采用welch檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Dunnett's T3法進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、白楊素和順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠有效地促進(jìn)多種人類腫瘤細(xì)胞死亡:順鉑處理三種人類腫瘤細(xì)胞株:順鉑分別以不同濃度對(duì)肝腫瘤細(xì)胞(Hep G2)5μ g/mL、結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT-116)10μ g/mL、鼻咽癌細(xì)胞(CNE1

11、)10μ g/mL處理24 h，倒置顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡，說(shuō)明順鉑在此劑量下對(duì)三種腫瘤細(xì)胞均為觀察到細(xì)胞毒性作用。同樣的單獨(dú)白楊素(Hep G240 M，HCT-11640μ M，CNE120μ M)處理三種人類腫瘤細(xì)胞株也未觀察到細(xì)胞死亡。然而三種人類腫瘤細(xì)胞在白楊素預(yù)處理2h后以順鉑聯(lián)合處理24 h均可以在倒置顯微鏡下觀察到腫瘤細(xì)胞是大量死亡。這也提示白楊素聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞死亡的促進(jìn)作用具有一定的廣譜性。進(jìn)一

12、步的流式細(xì)胞術(shù)分析亞二倍體峰，在Hep G2細(xì)胞定量分析結(jié)果顯示:白楊素聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞死亡的促進(jìn)作用具有劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。
　　2、白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)的腫瘤細(xì)胞死亡是半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)依賴的細(xì)胞凋亡:
　　為明確白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)的腫瘤細(xì)胞死亡是細(xì)胞凋亡，我們首先用細(xì)胞核特異性熒光燃料DAPI染色識(shí)別凋亡標(biāo)志性核固縮。白楊素預(yù)處理Hep G2細(xì)胞后與順鉑聯(lián)合處理24 h，可以觀察到含有核固縮的凋亡

13、細(xì)胞量顯著增加(F=18.050，P=0.007)，這為細(xì)胞凋亡提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)。為進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)論Western blot試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的兩個(gè)標(biāo)志性蛋白PARP(Poly(ADP-ribose)poly-merase cleavage)和半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)，結(jié)果顯示PARP和Caspase-3的前蛋白減少、活化裂解片段出現(xiàn)，而且總Caspase的抑制劑Z-VAD-fmk，能夠有效的抑制白楊素和順鉑聯(lián)合作用引起的細(xì)

14、胞死亡(F=85.883，P＜0.001)及逆轉(zhuǎn)標(biāo)志性凋亡蛋白（PARP和Caspase-3）的改變。
　　3、p53在白楊素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)的腫瘤凋亡作用中發(fā)揮重要的作用:
　　因?yàn)閜53在順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡中的重要作用，所以我們比較了白楊素聯(lián)合順鉑分別處理p53野生型肝腫瘤細(xì)胞(Hep G2)和p53缺失肝腫瘤細(xì)胞(Hep3B)誘導(dǎo)凋亡的差異:白楊索聯(lián)合順鉑處理腫瘤細(xì)胞24 h后，細(xì)胞核特異性熒光燃料Hoechst333

15、42染色，觀察到Hep G2細(xì)胞凋亡量顯著增加（t=-8.110，P=0.001）說(shuō)而Hep3B未見細(xì)胞死亡的顯著增加（t=-1.512，P=0.205）。隨后的p53蛋白分析可觀察到白楊素處理Hep G2細(xì)胞6h時(shí)p53蛋白水平就開始增加，而此時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)順鉑處理的Hep G2細(xì)胞中并未觀察到p53蛋白水平的改變。更為重要的是白楊素聯(lián)合順鉑處理對(duì)p53蛋白水平影響很顯著，尤其是在12 h時(shí)間點(diǎn)（F=17.822，P=0.003），這提示

16、p53蛋白在白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了作用。15位點(diǎn)絲氨酸磷酸化的p53蛋白水平也顯著增加(F=105.565，P＜0.001)與總p53蛋白水平的變化一致，且p-p53/p53值也顯著提高(F=39.068，P＜0.001)。這個(gè)結(jié)果可以在免疫熒光的結(jié)果中得到證實(shí)，15位點(diǎn)絲氨酸磷酸化的p53蛋白入核顯著增加（F=38.164，P＜0.001）。
　　4、白楊素通過(guò)影響p53下游的分子事件促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。<

17、br>　　5、白楊素通過(guò)活化ERK促進(jìn)p53在15位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化使p53活化入核發(fā)揮作用。
　　結(jié)論:
　　1、白楊素聯(lián)合順鉑可以有效促進(jìn)人類腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　2、白楊素預(yù)處理引起的p53蛋白活性增高是白楊素聯(lián)合順鉑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制。
　　3、在白楊素和順鉑聯(lián)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)效應(yīng)中，白楊素預(yù)處理活化了ERK1/2進(jìn)而磷酸化p53促進(jìn)p53調(diào)節(jié)的下游Bax和DR5高表達(dá)、Bcl-2低表達(dá)，最