腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制以及UPEC對(duì)HeLa細(xì)胞的致病性研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分產(chǎn)金屬β—內(nèi)酞胺酶合并外膜蛋白缺失引起腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的研究 目的：研究臨床分離的產(chǎn)酸克雷伯菌和陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥和/或敏感性降低的分子機(jī)制。 方法：臨床分離到一株對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的產(chǎn)酸克雷伯菌ZC101和一株對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感的陰溝腸桿菌ZY106。采用瓊脂稀釋法進(jìn)行抗生素最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定。以大腸桿菌EC600或C600

2、作為受體菌進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)。等電聚焦電泳(IEF)檢測(cè)產(chǎn)酸克雷伯菌ZC101、陰溝腸桿菌ZY106和它們的大腸桿菌接合子產(chǎn)β—內(nèi)酰胺酶情況。PCR和DNA測(cè)序確定耐藥基因的基因型。質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)證實(shí)外膜蛋白缺失是否可以引起對(duì)碳青霉烯類抗生素感性下降。十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)分析產(chǎn)酸克雷伯菌ZC101外膜蛋白表達(dá)情況，并對(duì)OmpK35和OmpK36基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA序列分析。Urea—SDS—PAGE分析陰

3、溝腸桿菌ZY106的外膜蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：亞胺培南、美羅培南和厄他培南對(duì)產(chǎn)酸克雷伯菌ZC101的MIC分別為16μg/ml、16μg/ml和128μg/ml；對(duì)陰溝腸桿菌ZY106的MIC分別為2μg/ml、4μg/ml和16μg/ml。 接合實(shí)驗(yàn)證實(shí)產(chǎn)酸克雷伯菌．ZC101可將耐藥質(zhì)粒傳遞給受體菌大腸桿菌EC600，使其對(duì)碳青霉烯類抗生素的敏感性明顯降低(MIC值至少上升4倍)。產(chǎn)酸克雷伯菌ZC101的blaIMp

4、-4編碼質(zhì)粒被消除后菌株仍然對(duì)碳青酶烯類抗生物素有較高的耐藥性。陰溝腸桿菌ZY106可將耐藥質(zhì)粒傳遞給大腸桿菌C600，使碳青霉烯類抗生素的MIC由接合前的≤0.0625μg/ml變?yōu)榻雍虾蟮?.25μg/ml～0.5μg/ml。 IEF、PCR擴(kuò)增和序列分析證實(shí)ZC101產(chǎn)IMP-4型金屬β—內(nèi)酰胺酶和CTX—M-14型超廣譜β—內(nèi)酰胺酶，而轉(zhuǎn)移接合子只產(chǎn)IMP-4。blaIMp-4基因位于大小約3000bp的Ⅰ類整合子上，該

5、整合子位于大小約55kb的質(zhì)粒上。同時(shí)證實(shí)ZY106中存在IMP-1型金屬β—內(nèi)酰胺酶和CTX—M-3型超廣譜β—內(nèi)酰胺酶，轉(zhuǎn)移接合子只產(chǎn)IMP-1。ZY106還同時(shí)攜帶有質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因qnrS1，將編碼該基因的質(zhì)粒通過接合試驗(yàn)轉(zhuǎn)移到受體菌大腸桿菌EC600中可使后者對(duì)環(huán)丙沙星中介耐藥(MIC：2μg/ml)。質(zhì)粒圖譜分析發(fā)現(xiàn)blaIMP-1位于大小約50kb的質(zhì)粒上，qnrS1基因位于大小約60kb的質(zhì)粒上。 產(chǎn)酸克雷

6、伯菌ZC101外膜蛋白的SDS—PAGE和ompK35和ompK36基因序列分析發(fā)現(xiàn)ZC101由于ompK36基因中存在插入序列IS5而導(dǎo)致OmpK36膜孔蛋白缺失。對(duì)陰溝腸桿菌ZY106外膜蛋白進(jìn)行Urea—SDS—PAGE分析發(fā)現(xiàn)有38kDa蛋白的缺失。 結(jié)論： 1、質(zhì)粒介導(dǎo)的IMP-4型金屬β—內(nèi)酰胺酶合并OmpK36膜孔蛋白缺失是引起產(chǎn)酸克雷伯菌ZC101對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。 2、質(zhì)粒介導(dǎo)的

7、IMP-1型金屬β—內(nèi)酰胺酶合并外膜蛋白缺失是引起陰溝腸桿菌ZY106對(duì)碳青霉烯類抗生素敏感性降低的主要原因，該菌株同時(shí)攜帶有質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnrS1。 第二部分尿道致病性大腸桿菌耐藥機(jī)制和對(duì)HeLa細(xì)胞致病性的分析 目的：了解尿路感染細(xì)菌分布情況，分析尿路感染大腸桿菌的耐藥性和超廣譜β—內(nèi)酰胺酶(ESBLs)檢出率，研究其對(duì)頭孢菌素和喹諾酮類抗生素的耐藥機(jī)制；了解尿道致病基因在其中的分布情況；通過HeLa細(xì)胞

8、模型篩選尿道致病性大腸桿菌強(qiáng)毒株，分析其對(duì)HeLa細(xì)胞的致病性。 方法：回顧性調(diào)查浙江省59家醫(yī)院2007年細(xì)菌分離狀況，以及不同地區(qū)大腸桿菌ESBLs檢出率和耐藥性；同時(shí)回顧性調(diào)查我院2000年～2008年9年間，我院臨床標(biāo)本和尿液標(biāo)本細(xì)菌分離情況、耐藥性和ESBLs檢出率，比較尿液分離大腸桿菌與不同標(biāo)本來源的大腸桿菌的耐藥性；采用特異性PCR檢測(cè)耐藥菌株的耐藥基因，DNA測(cè)序后序列與GenBank中已知序列對(duì)比確定基因型和基

9、因突變；采用PFGE分析菌株同源性，并通過PCR對(duì)尿路感染分離的大腸桿菌進(jìn)行分子分型；采用PCR檢測(cè)尿路感染患者分離的大腸桿菌的致病基因，分析致病基因的分布；通過黏附實(shí)驗(yàn)和胎盼蘭染色對(duì)尿路感染患者分離的大腸桿菌進(jìn)行強(qiáng)致病菌株的初步表型篩選，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)強(qiáng)致病菌株誘導(dǎo)：HeLa細(xì)胞早期凋亡的能力，在電子顯徼鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果：2007年浙江省59家醫(yī)院調(diào)查結(jié)果顯示，大腸桿菌的分離率處與首位；而且浙江省各地區(qū)大腸

10、桿菌ESBLs檢出率均在50％以上；對(duì)頭孢菌素的耐藥率在45％以上，對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥率最高，達(dá)60％以上；我院9年間回顧性調(diào)查顯示，尿液分離的細(xì)菌中大腸桿菌連續(xù)九年都處于首位；大腸桿菌的ESBLs的檢出率由2000年的7.2％上升到2008年的53.7％；頭孢菌素的耐藥率也由20％左右上升到50％以上，而環(huán)丙沙星和慶大霉素一直處于較高的耐藥水平，耐藥率分別為70％和60％左右。尿液分離的大腸桿菌的耐藥性與其它標(biāo)本來源的大腸桿菌比較顯

11、示，喹諾酮類抗生素和氨基糖苷類抗生素的耐藥率基本相同，而尿液分離的大腸桿菌對(duì)頭孢菌素的耐藥率明顯低于其它標(biāo)本分離的大腸桿菌。 通過病例查詢，我們選定了28例住院患者，其尿常規(guī)檢查白細(xì)胞均在2+以上，并且有尿路感染的癥狀。28株尿路感染患者分離的大腸埃希菌中，對(duì)頭孢噻肟耐藥率為64.29％，對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為71.43％。耐藥基因PCR檢測(cè)和DNA測(cè)序分析顯示，同時(shí)攜帶CTX—M-15和CTX—M-14基因的有2株，只攜帶CTX

12、—M-14的有16株。DNA測(cè)序分析喹諾酮耐藥菌株gyrA和parC發(fā)現(xiàn)，在QRDRs存在突變。而且檢測(cè)2株攜帶qnr基因，分別為qnrA1和qnrS1。PFGE結(jié)果顯示，尿液分離的大腸桿菌同源性比較低，只有兩株為同一克隆株，PCR分子分型顯示以D型為主，占60.71％，其次為B2型，占35.71％。 致病基因PCR檢測(cè)陽性率最高的為Ⅰ型菌毛基因，為96.43％，只檢測(cè)到6株usp基因陽性。通過致病表型篩選實(shí)驗(yàn)篩選到2株強(qiáng)致病性

13、大腸埃希菌(6N和27N)，攜帶多種致病基因。其中6N菌株攜帶usp基因，而27N不攜帶usp基因，其它致病基因與6N相同。PCR分子分型顯示，6N屬于B2型，而27N屬于D型。它們可以在3h破壞大量HeLa細(xì)胞，使HeLa死亡；流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示，6N菌株在1.5h可以誘導(dǎo)20.75％的HeLa細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，而27N只有1.55％的HeLa細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。電鏡結(jié)果從形態(tài)學(xué)證實(shí)6N菌株可以快速引起HeLa細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。