雌酮硫酸鈉多克隆抗體的制備與免疫分析法的研究.pdf

1、目的：利用抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)對(duì)微量抗原或抗體進(jìn)行測(cè)定的方法，研究制備雌酮硫酸鈉（Sodium estrone sulfate,ESS）多克隆抗體(polyclonal antibody,PcAb)及建立簡(jiǎn)單快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的膠體金免疫層析試紙條和酶聯(lián)免疫試劑盒分析雌酮硫酸鈉的方法。方法：（1）以雌酮硫酸鈉和牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)為主要原料，將ESS進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，經(jīng)各種譜圖鑒定確證結(jié)構(gòu)后，再

2、用混合酸酐法制備完全抗原，并以紫外掃描和凝膠電泳法分析完全抗原的偶聯(lián)比率，運(yùn)用合成的免疫原（Hapten-BSA,Hap-BSA）免疫家兔，采集血清，純化獲得雌酮硫酸鈉多克隆抗體。（2）用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備的適宜粒徑的膠體金進(jìn)行多克隆抗體標(biāo)記，膠體金標(biāo)記抗體經(jīng)純化后，噴涂于玻璃纖維膜上制成膠體金結(jié)合墊。將雌酮硫酸鈉的多克隆抗體(檢測(cè)線)和羊抗兔IgG(質(zhì)控線)分別噴涂在硝酸纖維素（Nitrocellulose ,NC)膜上。干燥后

3、依次將NC膜、膠金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊粘貼在膠板上，使用切刀切成3mm×5.5cm的試紙條，并通過(guò)檢測(cè)孕馬尿中雌酮硫酸鈉來(lái)確證它的特異性和靈敏度。(3)用過(guò)碘酸鈉改良法制備辣根過(guò)氧化物酶-雌酮硫酸鈉多克隆抗體蛋白結(jié)合物（Horseradish peroidase conjugated anti-ESS IgG, HRP-anti-ESS-IG），方陣滴定法確定包被最適工作濃度及HRP-anti-ESS-IgG最適稀釋倍數(shù)后，用雙抗夾心

4、法制備用于檢測(cè)孕馬尿中雌酮硫酸鈉的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。結(jié)果：（1）衍生后產(chǎn)物經(jīng)各種譜圖鑒定為雌酮硫酸鈉-17-肟。半抗原衍生物與載體蛋白BSA成功偶聯(lián)，其偶聯(lián)比為25.74。采用間接ELISA測(cè)定產(chǎn)生的抗血清稀釋度可以達(dá)到 1.28×105；經(jīng)親和層析法純化后蛋白濃度為3.179mg/mL。（2）采用檸檬酸三鈉法還原法制備膠體金，金顆粒直徑在10~20nm之間，滿足試紙條的要求，經(jīng)比較試驗(yàn)選用Millipore公司產(chǎn)品型號(hào)為HF135的

5、硝酸纖維膜作為層析試紙條材料；質(zhì)控線羊抗兔 IgG包被濃度為2 mg/mL，每條1.5μl；檢測(cè)線ESS-Pacb的包被濃度為1.6mg/mL，每條1.5μl；樣品墊、結(jié)合墊均采用 Millipore 公司的專用材料。檢測(cè)ESS標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度為30ng /mL。（3）雙抗夾心ELISA的檢測(cè)程序?yàn)椋河脻舛葹?0μg/mL抗體蛋白包被酶標(biāo)板，包被液為CB，包被條件為 4℃包被過(guò)夜；封閉液為1%牛血清白蛋白，封閉條件為室溫（23℃~25℃）孵