FIAU用于心臟報(bào)告基因顯像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:制備125I-FIAU，培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，構(gòu)建含HSV1-tk的腺病毒重組體，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞對(duì)該腺病毒重組體的易感性及感染后的活力，評(píng)估感染滴度及感染時(shí)間對(duì)心肌細(xì)胞體外攝取125I-FIAU的影響，為進(jìn)一步探討用腺病毒作為載體、HSV1-tk作為標(biāo)志性基因、放射性核素標(biāo)記的FIAU作為標(biāo)志性底物進(jìn)行心臟報(bào)告基因顯像的可行性打下基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1. FAU的碘化標(biāo)記及其在昆明小鼠體內(nèi)的生物分布

2、研究利用Iodogen固相氧化法碘化標(biāo)記FAU，標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物用Sep-Pak C18反相色譜柱進(jìn)行純化，用硅膠板薄層層析法測(cè)定125I-FIAU的放射化學(xué)純度和體外穩(wěn)定性，并研究其在昆明小鼠體內(nèi)的生物分布情況，著重分析在心肌及血液中的分布特性。
　　 2. 原代SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定取1～3d齡的SD大鼠乳鼠的心室組織，切成1mm3的小塊采用含牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的Ⅱ型膠原酶

3、單次消化心肌，1h后用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞后培養(yǎng)，全過(guò)程在25℃-37℃條件下進(jìn)行。在生物倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的形態(tài)，用免疫組織化學(xué)染色的方法進(jìn)行純度測(cè)定。
　　 3. Ad-CMV-HSV1-tk重組體的制備及鑒定用HSV1-tk作為報(bào)告基因，用巨細(xì)胞病毒作為啟動(dòng)子，腺病毒作為載體，構(gòu)建腺病毒重組體，本部分與北京本元正陽(yáng)公司合作。
　　 4.感染Ad5-tk的心肌細(xì)胞活性及感染滴度和感染時(shí)間對(duì)其體外攝取

4、125I-FIAU的影響。應(yīng)用腺病毒重組體將HSV1-tk基因轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞中，用MTT的方法評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞感染病毒重組體后的活力，分析細(xì)胞活力與感染滴度的關(guān)系；用RT-PCR的方法監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞感染病毒重組體后有無(wú)HSV1-tk mRNA存在，并在更換含125I-FIAU的培養(yǎng)基后分別于0.5h、1h、2h、3h、4h、5h時(shí)測(cè)定不同感染滴度下的心肌細(xì)胞對(duì)125I-FIAU的攝取率，分析攝取率與感染滴度和感染時(shí)間的相關(guān)性。
　　

5、結(jié)果:
　　 1. Iodogen固相氧化法能有效碘化標(biāo)記FAU，標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Sep-Pak C-18反相色譜柱純化后，125I-FIAU的放射化學(xué)純度為98.60%±0.52%（n=5）；125I-FIAU在正常人血清及PBS中37℃條件下穩(wěn)定，在0.5h～24h的時(shí)段內(nèi)放射化學(xué)純度>95％。生物分布實(shí)驗(yàn)顯示，125I-FIAU從血液中清除迅速，腎臟是主要排泄器官，心肌24h后幾乎無(wú)滯留。
　　 2. 用含牛血清白蛋

6、白（bovine serum albumin，BSA）的Ⅱ型膠原酶單次消化心肌，心肌組織在6 h時(shí)基本消化完全。5、10、15、20、25和30天時(shí)臺(tái)盼蘭染色法計(jì)算得到心肌細(xì)胞存活率均大于95％，30 d時(shí)仍為95.2％；生物倒置顯微鏡下觀察，24 h左右心肌細(xì)胞之間形成交聯(lián)，并有細(xì)胞搏動(dòng)；培養(yǎng)48 h的細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定心肌細(xì)胞純度為(97.1±1.9)％。
　　 3.與本元正陽(yáng)公司協(xié)作構(gòu)建腺病毒重組體，pDC316

7、-tk質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明序列正確，得到Ad-CMV-HSV1-tk腺病毒重組體的物理滴度為1.1×1012，感染滴度達(dá)到1.6×1010。
　　 4. MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞感染腺病毒重組體后的活力與感染滴度存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系；RT-PCR結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞感染腺病毒重組體后有HSV1-tk mRNA存在。攝取率結(jié)果顯示，腺病毒重組體感染后的心肌細(xì)胞體外對(duì)125I-FIAU的攝取率與感染滴度和感染時(shí)間呈明顯

8、正相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論: 用Iodogen固相氧化法和Sep-Pak C-18反相色譜柱純化可以快速制備符合實(shí)驗(yàn)要求的125I-FIAU，并且所制備的125I-FIAU具有較好的生物分布特性。應(yīng)用改良的方法可以更簡(jiǎn)單的培養(yǎng)出符合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)要求的心肌細(xì)胞。用腺病毒重組體做載體，可以將HSVI-tk基因成功轉(zhuǎn)導(dǎo)入心肌細(xì)胞，并且對(duì)125I-FIAU有較高的攝取率。因此，用腺病毒重組體作為載體，HSV1-tk作為標(biāo)志性基因，125I-