PCNA反義探針用于基因顯像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：以放射性核素標(biāo)記針對(duì)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)mRNA的反義寡核苷酸，通過一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，探討該標(biāo)記物作為一種分子探針應(yīng)用于反義顯像研究的價(jià)值。 方法：分別合成一段針對(duì)PCNAmRNA5'端非編碼區(qū)的反義和正義寡核苷酸，在雙功能螯合劑S-Acetyl-NHS-MAG3的螯合作用下，以99mTc進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后觀察標(biāo)記率，放射化學(xué)純度，標(biāo)記物與互補(bǔ)寡核苷酸的結(jié)合能力，標(biāo)記物在PBS和血清中的穩(wěn)定性；觀察該標(biāo)記物在增

2、殖旺盛的卵巢癌細(xì)胞中與靶基因特異性結(jié)合的能力和攝取動(dòng)力學(xué)，研究標(biāo)記物在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布，并對(duì)荷卵巢癌裸鼠進(jìn)行顯像；研究標(biāo)記物在增殖旺盛的血管平滑肌細(xì)胞中與目的基因特異性結(jié)合的能力和攝取動(dòng)力學(xué)。 1.寡核苷酸的偶聯(lián)和標(biāo)記 人工合成一段針對(duì)PCNAmRNA5'端非編碼區(qū)的含18個(gè)堿基的反義寡核苷酸，相應(yīng)的正義鏈合成后用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在相同條件下分別對(duì)正義和反義寡核苷酸進(jìn)行偶聯(lián)和標(biāo)記。在一定條件下，寡核苷酸與NHS-

3、MAG3發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，以0.7×28cmSephadexG25凝膠柱分離偶聯(lián)和游離的核酸。隨后以99mTc對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行標(biāo)記，以0.7×28cmSephadexG25凝膠層析柱對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記率的分析，以反相Sep-PakC18小柱進(jìn)行放射性化學(xué)純度分析。作為對(duì)照，以未偶聯(lián)MAG3的核酸按相同條件進(jìn)行標(biāo)記。將標(biāo)記物與PBS和新鮮人血清在37℃條件下孵育，上樣至Sep-PakC18小柱，觀察放射性峰的漂移情況和放射化學(xué)純度。分別將標(biāo)記的正

4、義和反義核酸與互補(bǔ)鏈在37℃條件下共同孵育1小時(shí)，再以Sep-PakC18小柱觀察洗脫液放射性峰值漂移情況，以判斷標(biāo)記物與互補(bǔ)鏈的分子雜交能力。 2.標(biāo)記物對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖以及對(duì)目的基因表達(dá)的影響 以MTT試驗(yàn)初步篩查反義探針對(duì)卵巢癌HO8910細(xì)胞的有效作用濃度；以5μM濃度的反義探針作用于HO8910細(xì)胞后，以流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞增殖情況；另外以RT-PCR和Western-blotting觀察一定濃度的反義、正義探針

5、對(duì)卵巢癌HO8910細(xì)胞PCNAmRNA和蛋白表達(dá)的影響。 3.標(biāo)記物在卵巢癌細(xì)胞株HO8910細(xì)胞中的攝取和清除 取卵巢癌HO8910細(xì)胞，加入標(biāo)記的反義、正義寡核苷酸后分別在37℃和22℃條件下培養(yǎng)，于不同時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)細(xì)胞和上清液中的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的攝取百分率。正義和反義探針與不同溫度下培養(yǎng)的細(xì)胞孵育達(dá)到最大攝取后更換為不含探針的培養(yǎng)液，分別在37℃和22℃條件下培養(yǎng)，于不同時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)細(xì)胞

6、和上清液中的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)放射性滯留率。 4.標(biāo)記物在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布以及對(duì)腫瘤模型的顯像研究 取正常雌性昆明小鼠70只，分為兩組，分別經(jīng)尾靜脈注射正義和反義探針，925kBq/只，在不同的時(shí)間點(diǎn)眼眶取血后將動(dòng)物引頸處死。取血、心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉、骨骼、卵巢、腦組織，生理鹽水沖洗后以濾紙擦干稱重，γ-計(jì)數(shù)器測(cè)各樣品和標(biāo)準(zhǔn)源放射性計(jì)數(shù)(cpm)，計(jì)算各臟器每克組織放射性占總注入放射性的百分比

7、。 取荷卵巢癌雌性裸鼠8只，隨機(jī)分為A、B、C三組。A組(n=3)和B組(n=3)分別經(jīng)尾靜脈注入18.5MBq(約10μgDNA)99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON；C組(n=2)每只尾靜脈注入非標(biāo)記的ASON10μg，2h后再注入99mTc-MAG3-ASON18.5MBq。每只動(dòng)物以800～1000mg/kg體重腹腔注射20％的烏拉坦(溶解于生理鹽水)麻醉。注入顯像劑后15min，30min，1h

8、，2h，5h，10h及18h，SPECT儀后位采集圖像。以低能高分辨率準(zhǔn)直器采集，距陣256×256，能峰設(shè)置140keV窗寬20％，放大倍數(shù)為4.0，每幀采集200s。 5.標(biāo)記物對(duì)增殖的血管平滑肌細(xì)胞增殖以及對(duì)目的基因表達(dá)的影響 以MTT試驗(yàn)初步篩查反義探針對(duì)增殖旺盛的血管平滑肌細(xì)胞的有效作用濃度；以5μM濃度的反義探針作用于增殖細(xì)胞后，以流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞增殖情況；另外以RT-PCR觀察一定濃度的反義、正義探針對(duì)血

9、管平滑肌細(xì)胞PCNAmRNA表達(dá)的影響。 6.標(biāo)記物在增殖的血管平滑肌細(xì)胞中的攝取和清除 將正義、反義探針以30ng/ml的濃度分別溶解于含10％和1％胎牛血清的DMEM中，分別加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及平臺(tái)期大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，在37℃條件下孵育，檢測(cè)不同時(shí)段的攝取百分?jǐn)?shù)。根據(jù)攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別以含反義和正義PCNA寡核苷酸探針的培養(yǎng)液培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期細(xì)胞，待探針達(dá)到最大攝取后更換為不含探針的培養(yǎng)液，洗滌數(shù)次后繼續(xù)培養(yǎng)，

10、分別檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)兩種探針在細(xì)胞中的滯留率。 MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，5μM濃度的99mTc-MAG3-ASON能顯著抑制HO8910細(xì)胞增殖，以此濃度的99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON分別作用于增殖的HO8910細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)前者能顯著減低細(xì)胞PCNAmRNA和蛋白的表達(dá)。 37℃條件下，卵巢癌細(xì)胞HO8910對(duì)99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON的攝取均于60mi

11、n時(shí)達(dá)到高峰，前者峰值明顯高于后者，分別為25.51％±3.56％和12.34％±2.45％，(P＜0.01，n=4)。22℃條件下，細(xì)胞對(duì)ASON和SON的攝取峰時(shí)為120min，峰值無明顯差異。37℃和22℃條件下，240min時(shí)99mTc-MAG3-ASON在HO8910細(xì)胞內(nèi)的滯留高于99mTc-MAG3-SON。22℃條件下，兩種探針在HO8910細(xì)胞中的清除速度均明顯低于37℃。 99mTc-MAG3-ASON和99

12、mTc-MAG3-SON在正常昆明小鼠體內(nèi)的時(shí)間生物學(xué)分布情況一致。放射性物質(zhì)主要經(jīng)腎臟和腸道排泄，早期放射性藥物主要分布于血液、肝臟和腎臟，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，肝臟、腎臟和血液中的放射性逐漸下降，腸道中的放射性分布逐漸濃聚，3h以后腸道放射性分布呈緩慢減低趨勢(shì)。但12h時(shí)，腸道放射性分布相對(duì)于6h上升，此時(shí)放射性主要分布于肝臟、腸道和血液。在整個(gè)過程中，卵巢、肌肉、骨骼、腦組織、肺和脾臟的放射性分布較低，隨時(shí)間推移緩慢減低。 注射9

13、9mTc-MAG3-ASON后30min，腫瘤部位開始出現(xiàn)放射性濃集，60min時(shí)腫瘤部位放射性濃聚最明顯，此時(shí)肝臟、膀胱及腸道亦可見放射性濃集，上腹部本底偏高，對(duì)側(cè)肢體相應(yīng)部位以及上肢和頭胸部顯像劑分布稀疏，T/NT=3.01±0.35(n=3)。隨后腫瘤組織放射性分布呈減低趨勢(shì)，但清除緩慢。至注射反義探針后10h，腹部放射性分布明顯減低，頭頸部及未接種腫瘤的肢體部位放射性分布明顯減低，腫瘤部位顯影逐漸清晰，此時(shí)顯像劑主要分布于腸道和

14、腫瘤部位，此時(shí)的T/NT=4.10±0.28(n=3)。在所有時(shí)間點(diǎn)，注射99mTc-MAG3-SON組和阻斷組腫瘤裸鼠腫瘤部位的放射性濃聚均較反義組低。 MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，5μM濃度的99mTc-MAG3-ASON可以顯著抑制細(xì)胞增殖。與99mTc-MAG3-SON相比，99mTc-MAG3-ASON可以顯著減低增殖的血管平滑肌細(xì)胞PCNAmRNA的表達(dá)。 99mTc-MAG3-ASON在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期平滑肌

15、細(xì)胞中的攝取顯著高于99mTc-MAG3-SON，但在平臺(tái)期細(xì)胞中兩者的攝取無顯著差異，99mTc-MAG3-ASON在對(duì)數(shù)期細(xì)胞中的攝取高于平臺(tái)期細(xì)胞。240min時(shí)，99mTc-MAG3-ASON在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中的滯留(79.6％±0.96％)高于99mTc-MAG3-SON(59.8％±0.75％)，P＜0.05，n=4。平臺(tái)期兩種探針的清除無顯著差異。 結(jié)論：在雙功能螯合劑S-Acetyl-NHS-MAG3的作用下，9