HSV1-tk-FIAU報(bào)告基因顯像系統(tǒng)在心肌細(xì)胞的體外攝取動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、目的： 構(gòu)建攜帶單純皰疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重組質(zhì)粒和重組腺病毒載體，對(duì)比研究重組腺病毒和脂質(zhì)體包裹的重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞后，對(duì)核素標(biāo)記的報(bào)告探針131I-FIAU的攝取和基因表達(dá)情況，為核素報(bào)告基因心臟顯像尋找合適的載體并提供基礎(chǔ)。 方法： 1．重組質(zhì)粒與重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定 以含巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的pDC316為載體質(zhì)粒，將報(bào)告基因HSV1-tk插入多克隆位點(diǎn)，構(gòu)

2、建重組質(zhì)粒pDC316-tk；以pDC316-tk作為重組穿梭質(zhì)粒，與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝生成腺病毒重組體Ad5-tk，本部分與北京本元正陽(yáng)公司合作完成。含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒Ad5-EGFP作為對(duì)照病毒。 2．SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌操作取1～3 d齡SD大鼠乳鼠心室組織，剪成1mm3的組織碎塊，采用0.1％II型膠原酶單次消化法消化組織塊，1 h差速貼壁法純化心肌細(xì)胞，于37℃、5

3、％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。生物倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察心肌細(xì)胞形態(tài)。 3．脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞 心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)90％融合時(shí)，重組質(zhì)粒pDC316-tk經(jīng)脂質(zhì)體lipofectamineTM 2000包裹(pDC316-tk/lipoplex)后加入培養(yǎng)孔內(nèi)，37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4h后將轉(zhuǎn)染液替換為含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24h。 4．重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞 心肌細(xì)胞貼

4、壁生長(zhǎng)達(dá)90％融合時(shí)，計(jì)數(shù)培養(yǎng)孔內(nèi)心肌細(xì)胞數(shù)目，以感染復(fù)數(shù)(MOI)20、40、80計(jì)算所需病毒體積，opti-MEM稀釋后加入培養(yǎng)孔中，37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4h后換成含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24h。 5．FAU的碘化標(biāo)記 采用Iodogen固相氧化法對(duì)FAU進(jìn)行放射性碘標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用Sep-Pak C-18反相色譜層析柱進(jìn)行純化和標(biāo)記率分析，TLC-SG硅膠板薄層層析法測(cè)定131I-FIAU的放射化學(xué)純

5、度和體外穩(wěn)定性。 6．Ad5-tk和pDC316-tk/lipoplex轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌細(xì)胞后體外攝取及基因表達(dá)的比較 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad5-tk和pDC316-tk/lipoplex后37℃孵育24h，進(jìn)行131I-FIAU的攝取實(shí)驗(yàn)，比較兩種載體介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后對(duì)報(bào)告探針的攝取效率；應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法，分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)不同載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后心肌細(xì)胞內(nèi)HSV1-tk的表達(dá)情況；用

6、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)導(dǎo)后心肌細(xì)胞活力。 結(jié)果： 1. 與本元正陽(yáng)公司協(xié)作構(gòu)建的重組質(zhì)粒pDC316-tk經(jīng)PCR、酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明序列正確，包裝生成的重組腺病毒Ad5-tk的物理滴度(v.p./ml)為1.1×1012，感染滴度(TCID50/ml)達(dá)1.6×1010。 2. 0.1％II型膠原酶單次消化法獲得的心肌細(xì)胞活力強(qiáng)，培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下見(jiàn)心肌細(xì)胞相互交聯(lián)，部分心肌細(xì)胞成團(tuán)跳

7、動(dòng)，48h可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞集落同步跳動(dòng)。 3. Iodogen固相氧化法能有效碘化標(biāo)記FAU，標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Sep-Pak C-18反相色譜柱純化后，峰管的標(biāo)記率為(53.82±2.05)％。經(jīng)TLC-SG硅膠板層析測(cè)定放射化學(xué)純度為(94.85±1.76)％(n=5)。標(biāo)記物在室溫下放置4、12、24h后，放射化學(xué)純度仍大于90％。 4. Ad5-tk和pDC316-tk/lipoplex轉(zhuǎn)導(dǎo)的心肌細(xì)胞對(duì)131I-FIAU

8、的攝取均隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在5h達(dá)最高攝取率，分別為(12.55±0.37)％，(2.09±0.34)％，但前者各時(shí)間點(diǎn)攝取率均高于后者(P<0.01)。兩種載體介導(dǎo)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后24h，RT-PCR即可檢測(cè)到HSV1-tk mRNA的表達(dá)，且Ad5-tk感染組的表達(dá)水平明顯高于pDC316-tk/lipoplex轉(zhuǎn)染組(3.11±0.14 vs 1.60±0.05，P<0.01)；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示Ad5-tk感染組和pDC316

9、-tk/lipoplex轉(zhuǎn)染組的陽(yáng)性率分別為(81.70±0.40)％、(22.06±0.32)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞感染高滴度Ad5-tk后細(xì)胞活力下降較pDC316-tk/lipoplex轉(zhuǎn)染組明顯。 結(jié)論： 用重組腺病毒和脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒做載體，均能成功介導(dǎo)報(bào)告基因HSV1-tk進(jìn)入心肌細(xì)胞，并表達(dá)生成有生物活性的酶對(duì)核素標(biāo)記報(bào)告探針131I-FIAU有明確的攝取，但通