MyoD基因局部轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞用于心肌重建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分MyoD基因重組腺病毒載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建MyoD基因重組腺病毒載體，為研究MyoD基因?qū)π募p傷的修復(fù)作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：從pEMSV-MyoD質(zhì)粒上用PCR方法擴(kuò)增出MyoDcDNA片段，并使MyoD基因加上CACC序列接頭，經(jīng)過定向拓?fù)淇寺∈鼓康幕蜻B接到轉(zhuǎn)移載體上，測序驗(yàn)證后用LR酶促反應(yīng)將目的基因轉(zhuǎn)移到腺病毒表達(dá)載體DNA上，獲得MyoD基因重組的腺病毒DNA，轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，包裝、擴(kuò)增

2、MyoD基因重組的腺病毒，測定病毒滴度，并對此病毒進(jìn)行PCR鑒定。 結(jié)果：經(jīng)PCR鑒定和DNA測序證實(shí)MyoD基因重組腺病毒含大小正確的目的片段，其DNA序列正確。病毒滴度為1.3-4.8×1011pfu/ml。 結(jié)論：成功構(gòu)建了MyoD基因重組腺病毒載體。 第二部分MyoD基因誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞向骨骼肌成肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 第一節(jié)大鼠心室成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 目的：探討大鼠心室成

3、纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法。 方法：無菌條件下剪取SD大鼠乳鼠心室肌，采用胰酶消化的方法獲取心室肌細(xì)胞，差速貼壁法分離心室成纖維細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，并用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測波形蛋白、纖維連接蛋白和平滑肌肌動蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：心室成纖維細(xì)胞在體外生長、增殖良好，生長迅速。剛分離出的心室成纖維細(xì)胞呈類圓形、三角形或多角形；24h-48h細(xì)胞體積增大，呈三角形、梭形或多角形；72h即呈融合狀態(tài)；消化

4、傳代后細(xì)胞生長速度加快，30min后開始貼壁，12h后貼壁完全，約2-3天即可傳代一次。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測培養(yǎng)的心室成纖維細(xì)胞波形蛋白、纖維連接蛋白表達(dá)均為陽性，平滑肌肌動蛋白表達(dá)陰性。 結(jié)論：胰酶消化、差速貼壁法是一種合適的心室成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法。 第二節(jié)MyoD基因誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞向骨骼肌成肌細(xì)胞分化 目的：探討MyoD基因誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化的可能性。 方法：

5、SD大鼠乳鼠10只，采用胰酶消化、差速貼壁法分離、培養(yǎng)心室成纖維細(xì)胞，將培養(yǎng)的第3代心室成纖維細(xì)胞分為3組：對照組、LacZ基因組、MyoD基因組。將MyoD基因和LacZ基因重組腺病毒原液以2000pfu/cell的濃度分別轉(zhuǎn)染前1天接種的成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時換無血清培養(yǎng)基，3h后洗去病毒，換完全培養(yǎng)基，40h后換成含2﹪胎牛血清的分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5天。相差顯微鏡及透射電鏡觀察對照組和誘導(dǎo)組細(xì)胞的形態(tài)；RT-PCR和Westernbl

6、ot方法檢測MyoD和肌細(xì)胞生成素(myogenin)的表達(dá)；免疫組化檢測骨骼肌肌球蛋白重鏈和結(jié)蛋白(desmin)的表達(dá)。 結(jié)果：對照組心肌成纖維細(xì)胞呈梭形、多角形、不規(guī)則形，胞體較大，細(xì)胞漿透明，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，未見肌絲結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)染MyoD基因重組腺病毒后，大鼠心肌成纖維細(xì)胞胞體伸展，逐漸變長，排列漸趨一致，7天后可見長梭形細(xì)胞平行排列走向，部分細(xì)胞融合形成肌管，胞漿內(nèi)可見肌絲束；轉(zhuǎn)染LacZ基因重組腺病毒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后形態(tài)無

7、變化，與對照組比較細(xì)胞形態(tài)無差別。RT-PCR可檢測出轉(zhuǎn)染MyoD基因后細(xì)胞表達(dá)MyoDmRNA；Westernblot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表達(dá)MyoD和myogenin；免疫組化檢測骨骼肌肌球蛋白重鏈和desmin表達(dá)均為陽性。 結(jié)論：MyoD基因可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞向骨骼肌成肌細(xì)胞分化，為進(jìn)一步研究MyoD基因?qū)π募p傷的修復(fù)作用奠定了基礎(chǔ)。 第三部分MyoD基因局部轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研

8、究第一節(jié)大鼠急性心肌梗死模型的建立 目的：探討建立大鼠急性心肌梗死模型的方法。 方法：30只SD大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組，每組各15只，麻醉后經(jīng)鼻腔插管連接動物呼吸機(jī)，切開胸廓暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動脈前降支，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，手術(shù)中觀察心電圖的變化，4周后行心臟二維超聲心動圖檢查，并取心臟標(biāo)本行病理檢查。 結(jié)果：手術(shù)組結(jié)扎冠狀動脈后，可見左室前壁逐漸由鮮紅轉(zhuǎn)變?yōu)榘底仙冶谂虺觯恍g(shù)后心電圖提示ST段明顯抬高

9、，呈一單向曲線；術(shù)后4周超聲檢查發(fā)現(xiàn)左心室前壁局部運(yùn)動異常伴有室壁瘤形成；心臟大體標(biāo)本可見左室前壁大面積灰白色心肌梗死區(qū)，局部心肌變薄，室壁塌陷形成室壁瘤。光鏡檢查提示假手術(shù)組心肌纖維規(guī)則排列，手術(shù)組梗死區(qū)心肌細(xì)胞胞漿凝固性壞死，纖維結(jié)締組織增生。 結(jié)論：開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支是建立大鼠急性心肌梗死模型切實(shí)可行的方法。 第二節(jié)局部注射MyoD基因重組腺病毒修復(fù)心肌梗死后心肌損傷的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究MyoD基因重

10、組腺病毒局部注入梗死區(qū)組織后對心肌損傷的修復(fù)作用。 方法：45只心肌梗死大鼠隨機(jī)分為MyoD基因組、LacZ基因組和對照組，每組15只，梗死1周后MyoD基因組在心肌梗死區(qū)注入100ul內(nèi)含2×1010pfuMyoD基因重組腺病毒的無血清DMEM，LacZ基因組注入同樣劑量LacZ基因重組腺病毒，對照組予以等量無血清DMEM培養(yǎng)液接種，注射部位用黑絲線標(biāo)記。干預(yù)治療后4周處死動物，獲取心臟標(biāo)本，RT-PCR檢測梗死區(qū)組織MyoD

11、mRNA的表達(dá)；送光鏡及電鏡檢查；免疫組化測定梗死區(qū)組織骨骼肌肌球蛋白重鏈和cTnI的表達(dá)；切片后1﹪TTC染色，測定梗死厚度、梗死面積，并計算其占左心室面積的百分比。 結(jié)果：MyoD基因轉(zhuǎn)染后在心肌梗死部位用RT-PCR方法檢測到MyoDmRNA的表達(dá)，而LacZ基因組和對照組無MyoDmRNA的表達(dá)；HE染色光鏡檢查顯示LacZ基因組和對照組梗死區(qū)鏡下見纖維結(jié)締組織增生，梗死區(qū)內(nèi)無肌肉組織，MyoD基因組梗死區(qū)內(nèi)見多處條索狀

12、、孤島狀不一的新生肌肉組織，其周圍血管豐富；透射電鏡LacZ基因組和對照組梗死區(qū)見纖維細(xì)胞，MyoD基因組梗死區(qū)內(nèi)見新生的帶橫紋的肌細(xì)胞，明暗帶清晰，未見閏盤結(jié)構(gòu)；免疫組化顯示MyoD基因組梗死區(qū)內(nèi)的肌肉組織骨骼肌肌球蛋白重鏈陽性，而cTnI陰性；TTC染色心肌存活區(qū)呈紅色，梗死區(qū)不著色，三組心臟左心室面積無顯著差異(P＞0.05)，MyoD基因組梗死厚度、梗死區(qū)面積及其占左心室面積的百分比明顯小于對照組和LacZ基因組(P＜0.01)

13、。 結(jié)論：MyoD基因重組腺病毒注入心肌梗死部位可以誘導(dǎo)骨骼肌樣細(xì)胞分化，修復(fù)心肌損傷。 第三節(jié)局部注射MyoD基因重組腺病毒對心肌梗死后心功能的影響 目的：研究MyoD基因重組腺病毒局部注入梗死區(qū)組織后對心功能的影響。 方法：50只SD大鼠以開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，成功45只，隨機(jī)分為對照組、LacZ基因組和MyoD基因組，每組15只，心梗后1周MyoD基因組在心肌梗死區(qū)注