假型病毒載體介導(dǎo)tPA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過(guò)新構(gòu)建的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(VSV-G/MuLV),介導(dǎo)組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plaminogen activator,tPA)基因,轉(zhuǎn)導(dǎo)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞,探索心肌成纖維細(xì)胞成為tPA基因治療靶細(xì)胞的可能性.方法:1、疹型口炎病毒殼G糖蛋白(VSV-G)替代MuLV的env蛋白,從而產(chǎn)生一種有轉(zhuǎn)染能力的以MuLV為基礎(chǔ)的病毒載體,稱為VSV-G假型MuLV載體(VSV-G/MuLV),通過(guò)293T/1

2、7細(xì)胞共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCnBgSN、pHIT60(for gal-pol)和pCVG(for VSV-G),采用磷酸鈣共沉淀法產(chǎn)生;VSV-G/MuLV病毒生產(chǎn)細(xì)胞293/GPG的產(chǎn)生;VSV-G/MuLV病毒上清的收集及滴度測(cè)定.2、采用兩次差速貼壁法(每次持續(xù)60分鐘)分離、培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維纖胞;通過(guò)倒置顯微鏡觀察心肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征;用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法(SP法)鑒定心肌成纖維細(xì)胞.3、制備含tPA基因假型病毒載體VSV-G/

3、tPA,通過(guò)質(zhì)粒pHIT60(for gal-pol)、pCVG(for VSV-G)和pLtSN(for tPA),同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生;含tPA基因的VSV-G/tPA病毒轉(zhuǎn)染293/GPG細(xì)胞,收集病毒上清并測(cè)滴度;含tPA基因的VSV-G/tPA病毒上清液轉(zhuǎn)染乳鼠心肌成纖維細(xì)胞,用G418藥物篩選,觀察轉(zhuǎn)染后心肌成纖維細(xì)胞克隆形成情況;發(fā)色底物法測(cè)定轉(zhuǎn)基因心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液中tPA蛋白活性在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后的動(dòng)態(tài)變化;免