宮頸脫落細胞用于產(chǎn)前遺傳診斷的研究.pdf

1、截至2006年5月31日，在線《人類孟德爾遺傳》(OMIM)數(shù)據(jù)庫收錄的遺傳性疾病達16811種[57,58]，遺傳病和各種先天性疾病的人數(shù)約占人口總數(shù)的0.6％[1]。對于大部分遺傳性疾病尚無有效的治療方法。目前產(chǎn)前診斷的疾病有染色體病、性連鎖遺傳病、遺傳代謝缺陷病及非染色體性先天畸形。對主要影響生存或生活質(zhì)量的遺傳病，主要通過遺傳咨詢，在妊娠期確診胚胎或胎兒患病，終止妊娠。尋找無創(chuàng)或微創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)是國際圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)研究的熱點

2、之一。 目前臨床上常用的侵襲性產(chǎn)前診斷技術(shù)有：①絨毛細胞檢查：在妊娠9周后進行，經(jīng)陰道或者經(jīng)腹取胎盤絨毛組織進行染色體核型分析，此檢查有利于早期的診斷，但對嵌合體診斷可靠性不如羊水細胞學(xué)檢查，且有胎兒畸形、肢體殘缺的報道；②羊水細胞學(xué)檢查：妊娠15周前禁做此項檢查，妊娠16～20周為最佳檢查時間，可診斷多種染色體疾病及基因疾病，為產(chǎn)前診斷最可靠的技術(shù)之一，但由于在孕中期進行而不利于早期的產(chǎn)前診斷；③胎兒臍血檢查：在孕中、晚期進行

3、，胎兒臍血可行染色體檢查及其他各種生化檢查，其結(jié)果也較為可靠，但風險較前二者為高，難以被廣大孕婦所接受，且不利于早期診斷。目前臨床上常用的非侵襲性產(chǎn)前診斷有：①從母血中分離胎兒有核紅細胞進行產(chǎn)前診斷，但由于胎兒有核紅細胞在母血中存在量極少，分離困難，技術(shù)上存在不足，且母血中胎兒細胞可持續(xù)存在至下次妊娠，限制了其應(yīng)用。②從母血中尋找胎兒基因片段，利用這些基因片段有進行產(chǎn)前診斷的可能，但利用游離胎兒DNA片段，不能獲得完整的遺傳信息，限制了

4、多種遺傳疾病的診斷，而有關(guān)Downs綜合征妊娠中游離胎兒DNA的含量目前仍有互相矛盾的證據(jù)[44]。③植入前診斷：僅適用于那些染色體重組風險高或因生育能力而行IVF術(shù)的婦女，且技術(shù)要求高。另外B超檢查、母血清中多種標記物的檢測作為產(chǎn)前篩查的手段，對產(chǎn)前診斷起輔助的作用。 采集宮頸脫落細胞的方法主要有四種：無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)、宮頸管灌洗術(shù)、宮腔內(nèi)灌洗術(shù)。各研究表明灌洗術(shù)獲得的標本胎兒細胞陽性率從28％～90％不等，對其它

5、方法取材結(jié)果報道不一，各種方法均存在標本胎兒細胞陽性率、胎兒細胞數(shù)量、診斷正確率不同的結(jié)果。目前的研究尚沒有對這四種取材方法能夠獲得多少滋養(yǎng)層細胞進行全面、系統(tǒng)、規(guī)范的比較，獲得的胎兒細胞陽性例數(shù)及細胞數(shù)量較多的孕周尚無定論。對取材孕周也有相互矛盾的報道。為選擇一個較好的經(jīng)宮頸取材方法，明確最佳的取材時期，以獲得較多的可代表胎兒細胞的滋養(yǎng)層細胞來進行產(chǎn)前診斷，并評價用這種方法獲得的細胞進行產(chǎn)前診斷的有效性，我們開展了此研究。 目

6、的： 1、了解早孕婦女生殖道胎兒細胞存在情況。 2、比較無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)、宮頸管灌洗術(shù)、宮腔內(nèi)灌洗術(shù)四種取材方法采集宮頸脫落細胞效率。 3、明確取材最佳時期。 4、用FISH法診斷胎兒性別，評價對伴性遺傳病高危孕婦的產(chǎn)前診斷效果。 方法： 選擇100例健康早孕(妊娠35～77天)婦女宮頸脫落細胞標本做HE染色及免疫細胞化學(xué)染色。用無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)各采集標本20例，用

7、宮頸管灌洗術(shù)、宮腔內(nèi)灌洗術(shù)各采集標本30例，依照上述分組染色后觀察滋養(yǎng)細胞存在情況。免疫細胞化學(xué)染色選用2種單克隆抗體：一種為抗HLA-G單克隆抗體，特異性作用于母胎界面的滋養(yǎng)層細胞，特異性高；一種為CK-7，對三種類型滋養(yǎng)層細胞均有表達，但特異性較低。100份宮頸脫落細胞標本每份分3組：HE染色組(Ⅰ)，抗HLA-G免疫細胞化學(xué)組(Ⅱa)，CK-7免疫細胞化學(xué)組(Ⅱb)。選擇80例要求行通水術(shù)且術(shù)中輸卵管通暢的健康婦女為對照，所得80

8、份經(jīng)宮頸標本每份分3組：HE染色組(Ⅲ)，抗HLA-G免疫細胞化學(xué)組(Ⅳa)，CK-7免疫細胞化學(xué)組(Ⅳb)。用四種方法采集標本各20例，染色后觀察滋養(yǎng)細胞存在情況。 比較四種不同的取材方法，不同取材時期，獲得滋養(yǎng)層細胞數(shù)和陽性率。對10名早孕男胎妊娠婦女的宮頸脫落細胞用熒光原位雜交判斷胎兒性別。 統(tǒng)計學(xué)方法：計數(shù)資料用X±S表示，兩組均數(shù)之間的比較用t檢驗，多組均數(shù)之間的比較用one-wayANOVA分析，計數(shù)資料用χ

9、2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件包及Excel2003軟件包處理。 結(jié)果： 1、HE染色對照組，未觀察到類合體滋養(yǎng)細胞樣細胞，HE染色計數(shù)的合體滋養(yǎng)層細胞可能來自胎兒。 2、抗HLA-G免疫細胞化學(xué)對照組，未觀察到胎盤滋養(yǎng)細胞陽性細胞，證明用單克隆抗體抗HLA-G行免疫細胞化學(xué)染色所得的陽性細胞為孕婦所特有，并且來自于胎兒。 3、CK-7免疫細胞化學(xué)對照組，未觀察到胎盤

10、滋養(yǎng)細胞陽性細胞，證明單克隆抗體CK-7行免疫細胞化學(xué)染色所得的陽性細胞也可能為孕婦所特有，來自于胎兒。 4、HE染色組無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)、宮頸管內(nèi)灌洗術(shù)、宮腔內(nèi)灌洗術(shù)取材標本胎兒細胞陽性率分別為40％、45％、83.3％、86.7％。 5、抗HLA-G免疫細胞化學(xué)染色組無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)、宮頸管內(nèi)灌洗術(shù)、宮腔內(nèi)灌洗術(shù)取材標本胎兒細胞陽性率分別為0％、0％、43.3％、53.3％。 6、CK7

11、免疫細胞化學(xué)染色組無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)、宮頸管內(nèi)灌洗術(shù)、宮腔內(nèi)灌洗術(shù)取材標本胎兒細胞陽性率分別為0％、0％、76.7％、80％。 7、四種標本采集方法獲得胎盤滋養(yǎng)層細胞數(shù)量的比較： (1)HE染色組及CK-7細胞免疫化學(xué)染色組：除無菌棉拭子術(shù)和宮頸粘液吸引術(shù)之間所得胎盤滋養(yǎng)層細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P＞0.05)，其余各取材方法之間所得胎盤滋養(yǎng)層細胞數(shù)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)，以宮腔內(nèi)灌洗術(shù)所得細

12、胞最多，無菌棉拭子術(shù)所得細胞最少。 (2)抗HLA-G免疫細胞化學(xué)染色組：除無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)之間和宮頸管灌洗術(shù)、宮腔內(nèi)灌洗術(shù)之間所得胎盤滋養(yǎng)層細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P＞0.05)，其余各取材方法之間所得胎盤滋養(yǎng)層細胞數(shù)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)，以宮頸管內(nèi)灌洗術(shù)/宮腔內(nèi)灌洗術(shù)所得細胞最多，無菌棉拭子術(shù)所得細胞最少。 8、獲得胎盤滋養(yǎng)層細胞數(shù)量的多少同采集標本時期呈正相關(guān)，隨著妊娠的繼續(xù)，所得標

13、本胎兒細胞陽性率越高，陽性細胞數(shù)量越多。 (1)HE染色組：用無菌棉拭子術(shù)所得標本胎兒細胞陽性率同采集時間有正相關(guān)(r=0.525，P=0.018)，妊娠周數(shù)越大，所得標本胎兒細胞陽性率越高，陽性細胞越多；用宮頸粘液吸引術(shù)所得標本胎兒細胞陽性率同采集時間無正相關(guān)(r=0.324，P=0.164)；用宮腔內(nèi)灌洗術(shù)、宮頸管內(nèi)灌洗術(shù)所得標本胎兒細胞陽性率同采集時間有正相關(guān)(r=0.533，0.566，P=0.002，0.001)，妊娠

14、周數(shù)越大，所得標本胎兒細胞陽性率越高，陽性細胞越多。 (2)抗HLA-G免疫細胞化學(xué)染色組：用無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)采集的標本染色后未見陽性細胞表達；用宮腔內(nèi)灌洗術(shù)、宮頸管內(nèi)灌洗術(shù)所得標本胎兒細胞陽性率同采集時間有正相關(guān)(r=0.500，0.472，P=0.005，0.009)，妊娠周數(shù)越大，所得標本胎兒細胞陽性率越高，陽性細胞越多。 (3)CK7免疫細胞化學(xué)染色組：采用無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)采集的標本染色后

15、未見陽性細胞表達；用宮腔內(nèi)灌洗術(shù)、宮頸管內(nèi)灌洗術(shù)所得標本胎兒細胞陽性率同采集時間有正相關(guān)(r=0.621，0.437，P=0，0.016)，妊娠周數(shù)越大，所得標本胎兒細胞陽性率越高，陽性細胞越多。 9、滋養(yǎng)層細胞含量：無菌棉拭子術(shù)、宮頸粘液吸引術(shù)、宮頸管灌洗術(shù)、宮腔內(nèi)灌洗術(shù)所得分別為218個/ml、208個/ml、658個/ml、1008個/ml。 10、抗HLA-G免疫細胞化學(xué)染色中標本采集方法與孕周無交互作用(P=0

16、.918)。 11、對10例宮頸脫落細胞用FISH判斷胎兒性別正確率為50％。陽性標本中，胎兒細胞所占百分比為4％～80％。 結(jié)論： 1、早孕婦女生殖道中存來源于胎兒細胞的滋養(yǎng)層細胞。 2、可在妊娠35～77天的早孕婦女的宮頸脫落細胞中發(fā)現(xiàn)可代表胎兒細胞的胎盤滋養(yǎng)層細胞的存在，這些細胞帶有胎兒的遺傳信息，從而為利用宮頸脫落細胞進行產(chǎn)前診斷奠定基礎(chǔ)。 3、無菌棉拭子術(shù)及宮頸粘液吸引術(shù)獲得滋養(yǎng)層細胞較

17、少，不是合適的取材方法。宮頸管灌洗術(shù)和宮腔內(nèi)灌洗術(shù)，與前兩者相比，獲得的宮頸脫落細胞標本陽性率及胎兒細胞數(shù)量較多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，是較好的取材方法。尤其是宮腔內(nèi)灌洗術(shù)，獲得的宮頸脫落細胞標本陽性率及胎兒細胞數(shù)量在四種取材方法所得中為最高。 4、抗HLA-G與母胎界面的滋養(yǎng)細胞發(fā)生陽性反應(yīng)，特異性較高，為胎兒細胞的分離進行產(chǎn)前診斷奠定了基礎(chǔ)。 5、標本中陽性率與陽性細胞數(shù)量與采集標本的時間有正相關(guān)性，與采集標本的方法及染