抗LunX和EpCAM抗體腫瘤生物治療研究.pdf

1、惡性腫瘤是當(dāng)今世界威脅人類健康和導(dǎo)致人類死亡的最嚴(yán)重疾病之一，如何有效治療惡性腫瘤已成為當(dāng)務(wù)之急。近年來，隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞水平到分子水平的進(jìn)一步認(rèn)識以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子靶向治療在臨床上取得了顯著的療效。研究癌癥發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)誘發(fā)癌變相關(guān)的特異性分子，再針對這些特異性的分子給予有力打擊，將會大大改善療效。單克隆抗體藥物憑其特異性高和毒性低已經(jīng)成為分子靶向治療研究的熱點(diǎn)，臨床實(shí)踐表明單克隆抗體卓著的療效已經(jīng)把腫瘤

2、的治療推向一個前所未有的新階段。
　　21世紀(jì)以來，抗體治療取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，已經(jīng)成為血液瘤和實(shí)體瘤治療最成功和最重要的策略之一。目前，抗體殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制和策略包括:阻斷或激活腫瘤細(xì)胞生長或凋亡的信號傳導(dǎo)，活化免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的腫瘤殺傷，偶聯(lián)功能效應(yīng)分子靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，靶向血管形成或腫瘤基質(zhì)細(xì)胞。一個單克隆抗體進(jìn)入臨床，需對其物理和化學(xué)等相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行全面檢測和分析;具體地說，包括分析識別的抗原表達(dá)水平，發(fā)揮的免疫效應(yīng)功能

3、和影響的信號通路，體內(nèi)的分布、活性以及半衰期等。但是，決定一個單克隆抗體是否能夠成為臨床藥物的關(guān)鍵是其療效和安全性。
　　一個單克隆抗體的療效和安全性主要取決于其識別的抗原靶點(diǎn)，因此尋找合適的治療靶點(diǎn)成為抗體治療的主要挑戰(zhàn)和瓶頸。理想中的靶向抗原應(yīng)該是高特異性，高豐度、明確的結(jié)構(gòu)和功能信息等。
　　肺癌已經(jīng)成為實(shí)體瘤中發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)肺癌特異的治療靶點(diǎn)，因此急需尋找有效的肺癌治療靶點(diǎn)，

4、從而有利于肺癌的早期診斷以及靶向治療。肺特異X蛋白（LunX）屬于PLUNC家族，前期研究發(fā)現(xiàn)LunX mRNA可作為肺癌診斷的特異性生物標(biāo)志物，而LunX蛋白與肺癌的相關(guān)性仍未報道。那么LunX蛋白是否廣泛表達(dá)于肺癌組織;是否促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展;是否可作為肺癌生物治療的靶標(biāo)？于是圍繞上述三個問題開展靶向LunX治療肺癌的相關(guān)性研究。
　　血液瘤現(xiàn)如今已是兒童和青少年腫瘤的頭號殺手。上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)是公認(rèn)的惡性腫瘤相

5、關(guān)抗原，過表達(dá)于肺癌，肝癌，胃癌等惡性實(shí)體瘤中，但在大部分正常人上皮細(xì)胞中也處于低表達(dá)狀態(tài)。EpCAM已成為多種實(shí)體瘤臨床免疫治療的靶點(diǎn)(Munz，Baeuerle et al.2009)。目前，EpCAM及其抗體的臨床應(yīng)用只局限于實(shí)體瘤，而其與白血病的相關(guān)性至今沒有通過大量臨床標(biāo)本進(jìn)行驗證;如果EpCAM過表達(dá)于白血病細(xì)胞，那么EpCAM可能也是白血病治療的新型靶點(diǎn)，其抗體也可作為白血病治療的潛在治療藥物。
　　本文主要從尋找肺

6、癌和血液瘤的治療靶點(diǎn)展開研究，獲得了如下結(jié)果:
　?、?、抗LunX抗體抑制非小細(xì)胞肺癌的生長及其轉(zhuǎn)移
　　本研究利用免疫組化技術(shù)分析150例肺癌病人的腫瘤組織和癌旁組織LunX蛋白表達(dá)水平;應(yīng)用卡普蘭-邁耶曲線分析其中108例病人術(shù)后生存周期和LunX表達(dá)量的相關(guān)性;為了研究LunX與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，通過免疫熒光技術(shù)檢測83例肺癌病人新鮮引流淋巴結(jié)、鎖骨上淋巴結(jié)穿刺標(biāo)本和胸水標(biāo)本中侵襲腫瘤細(xì)胞LunX表達(dá)水平，以及通過Lu

7、nX RNA干擾和過表達(dá)技術(shù)，驗證LunX與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。為了進(jìn)一步研究LunX參與的信號通路，利用免疫共沉淀和免疫印跡技術(shù)尋找LunX作用的靶蛋白以及調(diào)控的信號通路。最后研制LunX治療性抗體，通過體外抗體抑制試驗以及體內(nèi)肺癌移植模型小鼠驗證LunX抗體的功能。本研究通過上述研究方案取得了如下結(jié)果:
　　1.LunX表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌
　　檢測肺癌病人的腫瘤組織LunX蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LunX過表達(dá)于肺癌

8、組織并且陽性率達(dá)到90％，其中LunX蛋白表達(dá)越高的患者呈現(xiàn)更差的病理分期和更低的分化狀態(tài)，并且還發(fā)現(xiàn)LunX表達(dá)水平越高的病人呈現(xiàn)更低的生存率。此外，在多種肺癌細(xì)胞系中都可以檢測到LunX的廣泛表達(dá)。另外，在正常外周肺組織以及乳腺、肝臟、卵巢等其他器官中沒有檢測到LunX的表達(dá)。
　　2.LunX高表達(dá)于轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞
　　肺局部淋巴結(jié)和鎖骨上淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞全呈LunX陽性，并且，LunX表達(dá)越高的病人，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

9、移的陽性率也越高。此結(jié)果提示LunX與肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　3.LunX促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖及遷移
　　在不同LunX表達(dá)水平的肺癌細(xì)胞中，LunX表達(dá)水平高的肺癌細(xì)胞呈現(xiàn)更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。在A549和NCI-H292細(xì)胞中，干擾LunX能夠明顯抑制其增殖、遷移以及侵襲，過表達(dá)LunX，反之。
　　4.LunX通過活化14-3-3信號通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖及遷移
　　在肺癌細(xì)胞中，LunX直接作用于14-3-3蛋白，

10、并且通過阻斷14-3-3的磷酸化促進(jìn)其形成活化狀態(tài)的同源或異源二聚體，進(jìn)而活化下游的Erk1/2和JNK信號通路，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
　　5.靶向LunX小干擾RNA抑制肺癌的生長和轉(zhuǎn)移
　　在人肺癌原位，皮下瘤以及轉(zhuǎn)移的小鼠模型中，靶向LunX能夠抑制原位腫瘤的生長，局部侵襲、遠(yuǎn)端克隆病灶形成以及遠(yuǎn)端腫瘤病灶的生長;提示LunX可作為肺癌有效的治療靶點(diǎn)。
　　6.LunX抗體在體外能夠通過抗原抗體的內(nèi)吞和

11、降解抑制肺癌細(xì)胞的增殖及遷移
　　基于肺癌細(xì)胞過表達(dá)LunX， LunX蛋白存在于細(xì)胞膜表面以及LunX促進(jìn)肺癌的生長和轉(zhuǎn)移，于是制備和篩選了LunX抗體(S-35-8)，發(fā)現(xiàn)LunX抗體抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。LunX抗體的主要抗腫瘤機(jī)制是介導(dǎo)LunX蛋白的內(nèi)吞及降解，進(jìn)而抑制LunX下游信號通路。
　　7.LunX抗體在肺癌模型小鼠中抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移
　　LunX抗體能夠明顯抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并呈現(xiàn)劑量依

12、賴性。LunX抗體處理正常小鼠沒有出現(xiàn)明顯的組織炎癥和病理性特征。因此，初步結(jié)果顯示該抗體在體內(nèi)毒性較小，為后續(xù)抗體的人源化和治療奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，基于上述LunX蛋白的表達(dá)特異性和其促進(jìn)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的致癌機(jī)理，以及LunX體內(nèi)沉默后的腫瘤抑制以及阻斷性抗體的治療作用，可初步確認(rèn)LunX作為肺癌治療的新靶標(biāo)。該研究中的人源化治療性抗體有可能對肺癌臨床治療具有重要意義。
　?、颉⒖笶pCAM抗體抑制髓系血液瘤的形成

13、
　　本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各種類型血液瘤患者的骨髓和外周血標(biāo)本中EpCAM的表達(dá)，以及患者化療前后EpCAM陽性細(xì)胞的比例的變化。另外還通過體內(nèi)外的克隆形成和成瘤實(shí)驗，驗證EpCAM是否參與血液瘤的形成。制備EpCAM治療性抗體，并驗證其體內(nèi)抗腫瘤的效應(yīng)以及機(jī)制。獲得的結(jié)果如下:
　　1.EpCAM表達(dá)于髓系白血病和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞
　　在髓系細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤病人的骨髓標(biāo)本和外周血標(biāo)本中檢測到EpCAM的表

14、達(dá)，而在正常人的骨髓和外周血標(biāo)本中沒有檢測到EpCAM的表達(dá)。另外，髓系來源的白血病細(xì)胞系也呈EpCAM陽性。
　　2.EpCAM+白血病細(xì)胞具有更強(qiáng)的化療藥物耐藥性
　　在化療前后的同一病人標(biāo)本中，EpCAM+細(xì)胞占異常細(xì)胞的比例在化療后明顯升高，并且EpCAM-細(xì)胞比EpCAM+細(xì)胞對化療藥更敏感。提示EpCAM促進(jìn)白血病細(xì)胞的耐化療作用。
　　3.EpCAM抗體抑制白血病腫瘤病灶的形成
　　在K562和HL

15、60皮下瘤模型中，EpCAM抗體能夠抑制腫瘤的生長，當(dāng)抗體濃度遞增到80mg/kg（小鼠每千克體重）時，腫瘤病灶能夠完全被清除。在尾靜脈接種的移植瘤小鼠模型中， EpCAM抗體治療能夠抑制腫瘤在頸部淋巴結(jié)和骨髓等部位的形成，并且外周血中的腫瘤細(xì)胞數(shù)也明顯減少。該模型中，抗體能明顯延長小鼠的生存周期。
　　4.Macrophage介導(dǎo)抗抗EpCAM抗體的抗腫瘤作用
　　EpCAM抗體的治療促進(jìn)了脾臟F/80+Gr-1-的巨噬細(xì)