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文檔簡介
1、目的:本實驗研究為深入了解序貫調(diào)控hVEGF165/Ang-1基因表達誘導缺血心肌血管生成的作用和相關機制,提高基因治療應用的安全性、有效性提供了實驗依據(jù);同時,對進一步完善聯(lián)合基因治療缺血心臟病亦具有重要的理論意義及應用價值。
方法:成年日本大耳白兔,于冠狀動脈左室前降支中下1/3交界處結扎,建立兔心肌梗死動物模型,在此模型的基礎上,以2型重組腺相關病毒(rAAV2)為載體,將9HRE(低氧反應元件)調(diào)控的hVEGF16
2、5(人血管內(nèi)皮生長因子)及Tet-on-Advanced調(diào)控的Ang-1(血管生長素-1)采用心肌直接注射方法轉(zhuǎn)染兔梗死心肌,通過特定時間點體外主動給予強力霉素(Doxcycline, Dox),觀察兩系統(tǒng)對轉(zhuǎn)染hVEGF165與Ang-1基因的表達調(diào)控作用,檢測序貫調(diào)控hVEGF165與Ang-1基因表達對缺血心肌新生血管成熟及心臟功能的影響。實驗隨機分為8組:A組(雙基因序貫調(diào)控組):同期轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE- hVEGF165、
3、rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1混合液(混合比例為4:1:4),基因轉(zhuǎn)染6周后靜脈給予DOX誘導Ang-1表達。B組(雙基因非序貫調(diào)控組):同期轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE-hVEGF165、rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1混合液(混合比例為4:1:4),術后立即靜脈給DOX誘導Ang-1表達。C組(hVEGF165組):單獨轉(zhuǎn)染rAAV-9HRE-hVEGF165。
4、D組(Ang-1組):單獨轉(zhuǎn)染rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-TRE-Tight-Ang-1(混合比例為1:4),術后立即靜脈給DOX誘導Ang-1表達。E組(溶劑對照組):梗死區(qū)域注射等量生理鹽水,不予DOX誘導。F組(載體對照組)同期轉(zhuǎn)染rAAV-TRE-Tight-luciferase、rAAV-rtTA2s-m2和rAAV-9HRE-LacZ混合液(混合比例為4:1:4),轉(zhuǎn)染后處理同A組。G組(假手術組)開胸,在左前降
5、支中下1/3交界處穿線但不結扎,不予DOX誘導。H組(正常對照組)未開胸正常兔。
通過肉眼觀察、心電圖描記、HE染色和Masson三色染色驗證心肌梗死模型建立成功。采用Western blot方法檢測hVEGF165和Ang-1基因的表達。通過血管滲透性和FITC-Lectin灌注方法檢測新生血管的功能。超聲心動圖檢測評估心臟功能。
結果:
1.兔心肌梗死模型建立及檢測結果:
采用
6、結扎左冠狀動脈前降支中下1/3交界處的方法建立了兔心肌梗死模型,肉眼觀察可見結扎點下方心尖部及部分左室前壁心肌顏色由紅色變?yōu)樽仙?,面積約15mm×15mm,中心缺血區(qū)周邊部出現(xiàn)暗紅色充血帶。心電圖顯示,術后ST段弓背向上抬高,表明血管結扎完全,心肌梗死模型建立成功。肉眼觀察梗死區(qū)形成白色瘢痕組織。HE染色結果顯示,缺血梗死區(qū)的心肌細胞排列不齊,肌細胞數(shù)量減少,心肌細胞溶解后空泡形成,纖維化,梗死區(qū)大量炎性細胞浸潤。Masson三色染色示
7、,正常心肌纖維呈紅色,梗死區(qū)瘢痕膠原纖維呈藍色。
2.Westernblot檢測結果:
序貫組與溶劑對照組梗死區(qū)心肌組織均可檢測到hVEGF165蛋白表達,梗死形成初期表達即開始增加,6周時表達量達到高峰,此后表達量逐漸下降,12周時接近基礎值。與溶劑對照組相比,序貫組hVEGF165蛋白表達量明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
序貫組與溶劑對照組梗死區(qū)心肌組織均可檢測到Ang-1蛋白
8、表達,在模型建立后0,2,4,6周表達量極低,8,10,12周表達量增加。與溶劑對照組相比,心肌缺血后8,10和12周,序貫組Ang-1蛋白表達量明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
3.新生血管滲透性檢測結果:
12周肉眼觀察可見各結扎組心臟在梗死邊緣區(qū)及病毒注射部位均有少量藍色染料殘留。序貫組心臟梗死面積較小,有少量經(jīng)血管滲出并殘留于組織內(nèi)的染料。hVEGF165組心臟可見大片染料殘留。溶劑對照有
9、少量染料殘留,與序貫組相比無明顯差別。正常心臟基本無染料殘留。
單位重量心肌組織Evans blue含量(ng/mg)結果顯示,與非序貫組,hVEGF165組和Ang-1組相比,雙基因序貫組顯著減少,但高于假手術組和正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
4.新生血管Lectin灌注檢測結果:
功能血管數(shù)檢測結果顯示,與非序貫組、VEGF165組、Ang-1組、溶劑對照組和載體對照組相比,雙
10、基因序貫組明顯增加,但少于假手術組和正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
功能血管/新生毛細血管結果顯示,與hVEGF165組、Ang-1組、溶劑對照組及載體對照組相比,雙基因序貫組新生血管灌注功能明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
序貫組梗死邊緣區(qū)可見新生血管長入。
新生血管管徑結果顯示,與非序貫組、hVEGF165組、Ang-1組、溶劑對照組及載體對照組相比,序貫組管徑明顯增
11、粗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
新生血管側(cè)支數(shù)結果顯示,與非序貫組、Ang-1組、溶劑對照組及載體對照組相比,序貫組側(cè)支顯著增多,但低于hVEGF165組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
5.超聲心動圖檢測結果:
超聲心動圖檢測結果顯示,與其它各實驗組相比,序貫組動物心功能明顯改善,左心室收縮末期內(nèi)徑(LVSD)、舒張末期內(nèi)徑(LVDD)明顯減小。與非序貫組、hVEGF165組、An
12、g-1組、溶劑對照組和載體對照組相比,序貫組FS%值明顯提高,但低于假手術組和正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結論:
1、在動物整體水平,HIF-9HRE和Tet-on-advanced雙基因調(diào)控系統(tǒng)能有效調(diào)控hVEGF165和Ang-1基因的表達。
2、序貫調(diào)控hVEGF165/Ang-1基因表達可有效促進缺血心肌新生血管成熟及灌注功能的改善。
3、序貫調(diào)控hVEGF
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