PEDF對缺血心肌中VEGF表達及血管再生的影響.pdf

1、目的：色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF)是一種強力的血管再生抑制因子，PEDF能抑制血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial cellgrowth factor，VEGF)，影響血管生成(angiogenesis)。本研究分別將siPEDF-LV和PEDF-LV轉(zhuǎn)染大鼠梗死心肌，抑制或過表達PEDF，觀察對缺血心肌VEGF的表達及血管再生的影響。為進一步完善

2、缺血心臟病基因治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：成年SD大鼠，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，建立心肌缺血動物模型。構(gòu)建siPEDF-LV和PEDF-LV病毒載體，采用心肌直接注射方法轉(zhuǎn)染至缺血心肌組織。
　　實驗隨機分為6組：A組(正常組)：正常大鼠；B組(siPEDF表達組)：梗死心肌缺血轉(zhuǎn)染siPEDF-LV和Ehanced-Infection-Solution混合液(1:9)；C組(PEDF過表達組)：梗死心肌轉(zhuǎn)染PEDF-LV

3、Ehanced-Infection-Solution混合液；D組(載體對照組)：梗死心肌局部注射同等劑量NC-RNA-LV和Ehanced-Infection-Solution混合液；E組(溶劑對照組)：梗死心肌注射同等劑量生理鹽水；F組(單純梗死組)：單純行冠狀動脈結(jié)扎不注射任何試劑。
　　模型建立4周后，免疫熒光及Western blot檢測PEDF、VEGF、HIF-1α及TNF-α蛋白表達。免疫組織化學(xué)染色檢測VEGFR-

4、2陽性新生血管(Tip cell)數(shù)量，免疫熒光方檢測Fitc-LectinB4及α-SMA陽性血管數(shù)量，HE染色檢測心肌梗死區(qū)域炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)果：1大鼠心肌梗死模型建立及檢測
　　結(jié)扎左冠狀動脈前降支后，心肌顏色由鮮紅變?yōu)榘底仙?。ECG顯示，結(jié)扎后ST段弓背向上，心肌梗死模型建立成功。Masson三色染色顯示，正常心肌細胞呈紅色，梗死區(qū)瘢痕膠原纖維呈藍色。
　　2梗死心肌內(nèi)源性PEDF和VEGF表達
　　W

5、estern blot和免疫熒光雙標(biāo)顯示：正常大鼠心肌中內(nèi)源性PEDF蛋白高表達，心肌梗死后，內(nèi)源性PEDF蛋白表達降低，6周時達最低點，之后逐漸回升。正常心肌內(nèi)源性VEGF蛋白表達較少，心肌梗死后，表達開始升高，6周時達最高峰，之后逐漸下降。
　　心肌梗死后0-12周，內(nèi)源性PEDF和VEGF表達呈反向趨勢。
　　3病毒轉(zhuǎn)染效率檢測
　　siPEDF組、PEDF過表達組、載體對照組可檢測到綠色GFP蛋白表達，正常組、

6、溶劑對照組及單純手術(shù)組中未檢測GFP蛋白表達。
　　Western blot和免疫熒光檢測結(jié)果顯示：心梗后1周，與正常組、載體對照組、溶劑對照組及單純梗死組相比，siPEDF組PEDF表達量降低(P<0.05)，PEDF過表達組PEDF表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4梗死心肌中蛋白檢測結(jié)果
　　Western blot檢測結(jié)果顯示：模型建立4周時，與正常組、載體對照組、溶劑對照組及單純梗死組相

7、比，siPEDF組PEDF蛋白表達降低，VEGF和HIF-1α蛋白表達量顯著增多。PEDF過表達組PEDF表達明顯升高，VEGF和HIF-1α蛋白表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5 PEDF對梗死心肌血管再生的影響
　　新生血管檢測結(jié)果顯示：模型建立4周時，與正常組、載體對照組、溶劑對照組及單純梗死組相比，siPEDF組VEGFR2陽性細胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)。PEDF過表達組VEGFR2陽性

8、細胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　免疫熒光結(jié)果顯示：模型建立4周時，與載體對照組、溶劑對照組及單純梗死組相比，siPEDF組Fitc-LectinB4陽性血管數(shù)量顯著增加(P<0.05)，PEDF過表達組Fitc-LectinB4陽性的血管數(shù)量顯著減少(P<0.05)。siPEDF組及PEDF過表達組α-SMA陽性的血管數(shù)量與載體對照組、溶劑對照組及單純梗死組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

9、　　6炎癥因子檢測
　　模型建立4周時，與載體對照組、溶劑對照組及單純梗死組相比，siPEDF組炎癥細胞浸潤顯著增多，TNF-α表達顯著增加(P<0.05)。PEDF過表達組炎癥細胞浸潤顯著減少，TNF-α表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1、大鼠心肌梗死后0-12周期間，內(nèi)源性PEDF和VEGF表達呈反向趨勢。
　　2、抑制梗死心肌中PEDF表達，HIF-1α及VEGF表達升高；PEDF過表達，