ATD致粒細(xì)胞缺乏骨髓象及相關(guān)miRNA的初步研究.pdf

1、第一部分，ATD導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏患者骨髓特點(diǎn)分析
　　目的：分析抗甲狀腺藥物（Antithyroid drug, ATD）治療導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏癥患者骨髓象特點(diǎn)及相關(guān)臨床資料，探索骨髓象特點(diǎn)與粒細(xì)胞恢復(fù)情況及臨床預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：檢索2008年1月～2011年12月南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院、南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院、南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科及內(nèi)分泌科收治的有完整診療過程記錄及骨髓檢查結(jié)果的住院病歷,骨髓涂片提示取材不理想的病例予以

2、剔除。確定33例為本研究的對(duì)象。總結(jié)分析其骨髓象特點(diǎn)、粒細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間、熱程長(zhǎng)短等指標(biāo)。
　　結(jié)果：ATD導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏患者骨髓特點(diǎn)可以分為粒系成熟障礙型及粒系再生障礙型兩類。33例粒缺患者中骨髓象為成熟障礙型13例(39.4％)、再生障礙型20例(60.6%)，再生障礙型組骨髓增生活躍15例，增生減低5例。成熟障礙型組骨髓增生明顯活躍3例，增生活躍10例。成熟障礙型患者粒細(xì)胞上升至正常平均（4.7±1.0）天，而再生障礙型為（8.

3、0±2.8）天,兩組比較差異有顯著性（P＜0.01），發(fā)熱天數(shù)在成熟障礙型組為（3.6±2.5）天，再生障礙型組為（8.6±3.1）天，成熟障礙型組熱程明顯短于再生障礙型組（P＜0.01），2例死亡患者骨髓檢查為再生障礙型。
　　結(jié)論：1、ATD導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏患者骨髓象可以分為粒系再生障礙型和成熟障礙型兩類，以粒系再生障礙型為主。2、骨髓象為成熟障礙型患者較再生障礙型患者粒細(xì)胞恢復(fù)快，發(fā)熱時(shí)間短，預(yù)后好。
　　第二部分，AT

4、D導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏患者血漿差異表達(dá)miRNA的篩選及鑒定
　　目的：研究 ATD導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏患者粒細(xì)胞缺乏時(shí)及粒細(xì)胞恢復(fù)正常后血漿miRNA表達(dá)譜的變化。
　　方法：選取年齡、性別、服用ATD類別及療程基本匹配的5名ATD導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏患者，抽取粒細(xì)胞缺乏時(shí)及粒細(xì)胞恢復(fù)正常1周后的外周靜脈血各2ml，分離血漿提取總RNA，應(yīng)用Agilent human miRNA(8*60K) V16.0芯片分析粒細(xì)胞缺乏時(shí)及粒細(xì)胞恢復(fù)正常

5、后 miRNA表達(dá)譜的差異。生物信息學(xué)分析表達(dá)差異明顯的miRNA的靶基因及功能。qRT-PCR驗(yàn)證低表達(dá)hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b在ATD導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏時(shí)及粒細(xì)胞恢復(fù)正常后及服用ATD3月以上未出現(xiàn)粒細(xì)胞減少患者血漿中的表達(dá)情況。結(jié)合患者臨床資料，分析 hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b表達(dá)變化與患者服用

6、ATD類別及骨髓特點(diǎn)分類的關(guān)系。
　　結(jié)果：通過對(duì)芯片進(jìn)行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析，篩選獲得32個(gè)ATD導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏相關(guān)miRNA，其中9個(gè)表達(dá)上調(diào)(Fold change,FC≥2)，23個(gè)表達(dá)下調(diào)（FC≤0.5）；顯著上調(diào)的有hsa-miR-200、hsa-miR-756、hsa-miR-320a、hsa-miR-21、hsa-miR-30a、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320e(FC≥5)，顯著下調(diào)的有hsa-

7、miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b、hsa-miR-1234、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-15a、hsa-miR-197、hsa-miR-144（FC≤0.2）。生物信息學(xué)分析提示低表達(dá)的miRNA與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，高表達(dá)miRNA多參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)等過程。進(jìn)一步對(duì)低表達(dá)hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-mi

8、R-106b、hsa-miR-19b的qRT-PCR驗(yàn)證，證實(shí)了芯片結(jié)果可靠。qRT-PCR驗(yàn)證的4個(gè)miRNA表達(dá)變化在服用MMI和PTU兩組患者間無明顯差異（p＞0.05）。且4個(gè)低表達(dá)miRNA在骨髓分類為粒系再生障礙型和粒系成熟障礙型兩組患者間差異不明顯（p＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、通過miRNA芯片篩選及qRT-PCR檢測(cè)，成功獲得ATD導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏發(fā)生相關(guān)的血漿miRNA譜。
　　2、ATD致粒

9、細(xì)胞缺乏的miRNA表達(dá)變化與服用ATD類別及骨髓特點(diǎn)分類無明顯相關(guān)。
　　3、粒細(xì)胞缺乏時(shí)差異低表達(dá)的hsa-miR-20a、hsa-miR-223、hsa-miR-106b、hsa-miR-19b等均與細(xì)胞凋亡相關(guān)，提示粒細(xì)胞凋亡增加可能是ATD致粒細(xì)胞缺乏發(fā)生的原因。
　　第三部分，Hsa-miR-20a對(duì)HL-60、U-937細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響
　　目的：選取miRNA芯片篩選獲得的顯著低表達(dá)的hsa-miR

10、-20a作為研究對(duì)象，觀察hsa-miR-20a表達(dá)變化對(duì)HL-60、U-937細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。
　　方法：構(gòu)建hsa-miR-20a低表達(dá)及高表達(dá)慢病毒載體，感染293T細(xì)胞，采用熒光檢測(cè)法測(cè)定病毒的滴度。復(fù)蘇培養(yǎng)HL-60、U-937細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為三組：hsa-miR-20a高表達(dá)組（hsa-miR-20a up）、hsa-miR-20a低表達(dá)組（hsa-miR-20a down）、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)染組（control）。取

11、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞根據(jù)病毒滴度及MOI值加入慢病毒感染，分別于感染后48h、72h鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變，MTT及FCM檢測(cè)各組細(xì)胞增殖及凋亡的情況。qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞hsa-miR-20a表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建低表達(dá)及高表達(dá)hsa-miR-20a的慢病毒載體，hsa-miR-20a up慢病毒滴度為4×108TU/ml, hsa-miR-20a down慢病毒滴度為8×108TU/ml。兩組病毒成功感染HL-60、

12、U-937細(xì)胞，qRT-PCR證實(shí)了感染后各組細(xì)胞hsa-miR-20a表達(dá)水平的變化，低表達(dá)hsa-miR-20a可以抑制HL-60、U-937細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡。而且， hsa-miR-20a低表達(dá)對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及凋亡促進(jìn)作用較U-937細(xì)胞更加明顯（p＜0.05）。高表達(dá)hsa-miR-20a對(duì)兩組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及凋亡的影響與對(duì)照組無明顯差異（p＞0.05）。
　　結(jié)論：Hsa-miR-20a低表達(dá)及高表達(dá)慢病毒載

13、體可以在HL-60、U-937細(xì)胞中實(shí)現(xiàn) hsa-miR-20a的低表達(dá)及高表達(dá)變化。Hsa-miR-20a低表達(dá)可抑制 HL-60、U-937細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡。其對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及凋亡促進(jìn)作用較 U-937細(xì)胞更加明顯。
　　第四部分，Hsa-miR-20a調(diào)控粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　目的：探索hsa-miR-20a調(diào)控HL-60細(xì)胞凋亡的靶向基因及其作用機(jī)制。
　　方法：生物信息學(xué)軟件在線分析hsa-

14、miR-20a的種子序列，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶向基因及其3’UTR作用位點(diǎn)，位點(diǎn)結(jié)合自由能等生物信息。選取可能的靶向作用位點(diǎn)構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體，檢測(cè)軟件預(yù)測(cè)位點(diǎn)的有效性。RT-PCR及Western-blot檢測(cè)hsa-miR-20a表達(dá)變化對(duì)靶向基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響。并采用Western-blot檢測(cè)靶向蛋白的下游調(diào)控蛋白表達(dá)水平變化情況。免疫組化檢測(cè)ATD導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏患者骨髓粒細(xì)胞中相應(yīng)靶向蛋白的表達(dá)情況。
　

15、　結(jié)果：多生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)均發(fā)現(xiàn)hsa-miR-20a與PTEN3’UTR有很好的作用位點(diǎn)及結(jié)合自由能。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 hsa-miR-20a高表達(dá)能使psiCHECK?-2-PTEN-WT3’UTR質(zhì)粒的表達(dá)水平顯著下降，而對(duì)psiCHECK?-2-PTEN-Mut3’UTR質(zhì)粒的表達(dá)無影響。RT-PCR檢測(cè)PTEN mRNA水平變化發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，hsa-miR-20a up能顯著下調(diào)PTEN mRNA水平。We

16、stern-blot檢測(cè)結(jié)果顯示隨著hsa-miR-20a表達(dá)的下降，HL-60細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組顯著上調(diào)，而PTEN下游調(diào)控蛋白p-Akt、Bcl-2表達(dá)水平下降，Bax表達(dá)升高。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)粒系成熟障礙型患者骨髓粒細(xì)胞 PTEN蛋白表達(dá)量較正常骨髓象有增加。
　　結(jié)論：PTEN是 hsa-miR-20a調(diào)控粒細(xì)胞凋亡的靶向基因，PTEN通過影響線粒體凋亡信號(hào)p-Akt/Bcl-2/Bax通路在ATD導(dǎo)致粒細(xì)