紅系分化相關(guān)基因分析及人造血相關(guān)miRNA和miRNA基因簇的初步研究.pdf

1、血細(xì)胞形成是生物體發(fā)育和生命維持最重要的環(huán)節(jié)之一。為進(jìn)一步獲得分化過程中相關(guān)基因表達(dá)的信息，應(yīng)用改良的差異顯示RT-PCR技術(shù)(DDRT-PCR)，分析K562細(xì)胞在Hemin誘導(dǎo)的紅系分化前后的基因表達(dá)變化，共獲得357條差異表達(dá)帶。對(duì)其中差異表達(dá)明顯的314條進(jìn)行再擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，其中201條表達(dá)上調(diào)，85條表達(dá)下調(diào)。對(duì)這些差異表達(dá)EST的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，237個(gè)EKT與GenBank中已知序列有95％以上同源性，45個(gè)為只與

2、dbEST有高度同源的序列，4個(gè)未發(fā)現(xiàn)同源序列。這些已知基因多為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、分化相關(guān)分子、細(xì)胞凋亡相關(guān)分子、腫瘤相關(guān)分子、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白和氧化還原酶及其它酶類等，還有一些已知cDNA而未知功能的基因和幾個(gè)可能的新基因。同時(shí)，運(yùn)用Microarray技術(shù)，分析了K562細(xì)胞紅系分化前后的miRNA表達(dá)，獲得了21個(gè)差異表達(dá)miRNA。miRNA是一類長度約為21-23個(gè)核苷酸的重要調(diào)節(jié)分子，它可以通過mRNA剪切或翻譯抑制的方式在轉(zhuǎn)錄后

3、水平抑制蛋白編碼基因表達(dá)。迄今為止在植物和動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)編碼miRNA的基因1000余個(gè)。miRNA在許多發(fā)育和生理過程中起著重要的作用，但目前已闡明部分功能和作用機(jī)制的miRNA R有少數(shù)。近來Bartel等報(bào)告，mir-223在小鼠骨髓中特異性表達(dá)。 本文為研究mir-223在人類造血中的功能作用，首先用Northern雜交方法分析了其在人正常組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)mir-223在人淋巴結(jié)、肝和骨髓中高表達(dá)，在其他組織中低或無表

4、達(dá)，這與Barrel在小鼠組織的雜交結(jié)果有部分區(qū)別。隨后通過密度梯度離心結(jié)合抗體磁珠分選的方法從臍血單個(gè)核細(xì)胞中分離出5種鏈系細(xì)胞(T、B、粒、單核和紅系)，檢測(cè)了mir-223表達(dá)。結(jié)果表明：mir-223在紅系和T系表達(dá)較低，在B系中等程度表達(dá)，而在單核系和粒系中高表達(dá)。之后檢測(cè)了mir-223在9個(gè)白血病細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其不但在2個(gè)髓系來源白血病細(xì)胞系HL-60和THP-1中表達(dá)，也在2個(gè)紅白血病細(xì)胞系K562和HEL中表達(dá)。

5、但在小鼠紅白血病細(xì)胞系MEL585和GM979中卻未檢測(cè)出mir-223表達(dá)。這些情況暗示，在作為比小鼠更高級(jí)的哺乳動(dòng)物-人中,miRNA可能在發(fā)育過程中調(diào)控更多的生理和病理進(jìn)程。 為進(jìn)一步研究mir-223在人紅系分化發(fā)育中的功能，文中以K562和HEL為研究模型，分析外源性抑制或過表達(dá)成熟mir-223后對(duì)兩種細(xì)胞生長和分化的影響。結(jié)果表明：外源性抑制或過表達(dá)成熟mir-223對(duì)兩種細(xì)胞的增殖和凋亡沒有影響，而外源性抑制了

6、成熟mir-223的兩種細(xì)胞在用Hemin向紅系誘導(dǎo)后，相比于對(duì)照Hemin誘導(dǎo)組，均表現(xiàn)出一定程度的紅系分化增強(qiáng)。這表明mir-223可能在人紅系分化中具有一定抑制作用，但尚需進(jìn)一步研究。許多證據(jù)表明多個(gè)miRNA可能以協(xié)同方式在某一生物過程中發(fā)揮作用。 本研究首先使用Altuvia等的方法分析了所有已注冊(cè)的326個(gè)人miRNA基因的基因組定位情況，發(fā)現(xiàn)148個(gè)miRNA基因組織在51個(gè)miRNA基因簇里，并用啟動(dòng)子分析得到

7、驗(yàn)證。序列相似性分析揭示在不同的miRNA基因簇之間存在許多高度同源的miRNA基因。為進(jìn)一步探究這些成簇miRNA在人造血系統(tǒng)中的功能，用northern blot方法分析了它們?cè)诓煌娜税籽〖?xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果說明在39個(gè)miRNA簇中，屬于同一個(gè)簇的miRNA成員在不同的人造血細(xì)胞系中具有一致性表達(dá)。不一致的表達(dá)在另12個(gè)基因簇中發(fā)現(xiàn)。從中鑒定了幾個(gè)造血鏈系特異或豐富表達(dá)的miRNA簇(例如：mir-29c，mir-302，mi