強(qiáng)力霉素促進(jìn)小鼠胸腺上皮細(xì)胞分泌IL-6及GM-CSF機(jī)制初步研究及抗PRD片段缺失的hFOXP3單抗的制備.pdf

1、本文分兩部分，第一部分，目的：強(qiáng)力霉素(Doxycycline，Dox)屬于四環(huán)素類的抗生素，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)小鼠胸腺上皮細(xì)胞系(thymicmedullary-type epithelial cell line1，MTEC1)的增殖，本研究探討了Dox促進(jìn)MTEC1分泌IL-6和GM-CSF的作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步探索Dox在免疫重建中可能的應(yīng)用前景奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：運(yùn)用定量PCR及ELISA方法，在mRN

2、A和蛋白質(zhì)水平上分析了Dox對(duì)MTEC1細(xì)胞表達(dá)IL-6和GM-CSF的調(diào)控作用，然后應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)(Western blot)對(duì)Dox處理后MTEC1細(xì)胞內(nèi)與IL-6和GM-CSF基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NF-KB磷酸化的p65(p-p65)的表達(dá)水平進(jìn)行分析。最后，為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)p65及ERK通路對(duì)Dox促進(jìn)MTEC1細(xì)胞分泌IL-6及GM-CSF的作用，分別采用p65磷酸化抑制劑BAY11-7082和ERK抑制劑U0126預(yù)先處理

3、MTEC1，繼而加入Dox處理MTEC1，以ELISA、定量PCR、Western blot等方法分析p65及ERK通路的作用。
　　 結(jié)果：本研究發(fā)現(xiàn)Dox在mRNA及蛋白水甲上均可促進(jìn)MTEC1細(xì)胞表達(dá)IL-6及GM-CSF，且具有時(shí)間及劑量依賴性。Western blot分析也顯示了類似的結(jié)果，p-p65蛋白水平顯著上升。隨著抑制劑BAY11-7082和U0126濃度的增加，Dox這種促分泌作用被逐漸抑制。
　　

4、結(jié)論：Dox可通過NF-KB及MAPK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)MTEC1表達(dá)IL-6及GM-CSF。由于胸腺是T細(xì)胞發(fā)育的重要器官，而胸腺上皮細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子的方式對(duì)胸腺細(xì)胞的發(fā)育又具有重要的調(diào)控作用。因此Dox可能具有通過促上皮細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌作用從而促進(jìn)T細(xì)胞的重建，但尚需進(jìn)一步的探索。
　　 第二部分，目的：制備抗脯氨酸富含區(qū)缺失的人FOXP3(delete rich prolinedomain of human FOX

5、P3，△PRD-hFOXP3)的單克隆抗體(mAb)，為進(jìn)一步研究人FOXP3各片段功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：以純化的△PRD-hFOXP3重組蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0進(jìn)行常規(guī)融合，經(jīng)篩選及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb雜交瘤細(xì)胞株；利用核型分析、間接ELISA及Western blot分別鑒定了雜交瘤的細(xì)胞核型、抗體的效價(jià)與特異性。
　　 結(jié)果：篩選