強(qiáng)力霉素保護(hù)小鼠胸腺上皮細(xì)胞系(MTEC1)抵抗細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究及強(qiáng)力霉素多克隆抗體的制備.pdf

1、第一部分
　　目的:本研究主要通過絲裂霉素C(Mitomycin C，MMC)體外誘導(dǎo)胸腺上皮細(xì)胞系（Mouse thymic epithelial cells line1，MTEC1）凋亡，來研究強(qiáng)力霉素(Doxycycline，Dox)保護(hù)MTEC1細(xì)胞，抵抗凋亡的分子機(jī)制。為強(qiáng)力霉素應(yīng)用于老年性免疫缺陷、嚴(yán)重感染(HIV)和移植排斥反應(yīng)所引起的T細(xì)胞免疫缺陷的重建奠定實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)。
　　方法:不同濃度Dox、MMC和

2、Dox+MMC處理MTEC1不同時(shí)間后，采用CCK-8法、Hoechst33342染色、流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot技術(shù)綜合分析Dox保護(hù)MTEC1抵抗MMC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象和機(jī)制。
　　結(jié)果:本研究發(fā)現(xiàn)Dox具有保護(hù)MTEC1抵抗MMC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象;進(jìn)一步通過Western Blot檢測相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)Dox抗凋亡的機(jī)制為上調(diào)Trx2，p-NF-κB，Bcl-2表達(dá)，而下調(diào)Bax的表達(dá)。
　　結(jié)論:本研究首次

3、揭示了Dox通過Trx2途徑保護(hù)MTEC1抵抗MMC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，為今后臨床研究Dox保護(hù)胸腺上皮細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞的重建提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　第二部分
　　目的:本實(shí)驗(yàn)采用人工偶聯(lián)方法構(gòu)建Dox完全抗原，制備多克隆抗體，為今后研究強(qiáng)力霉素作用靶點(diǎn)及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:分別采用直接偶聯(lián)法、甲醛一步法、重氮法+混合酸酐法和重氮法+碳二亞胺法等四種方法將Dox與BSA/OVA分別進(jìn)行偶聯(lián)，構(gòu)建為完全人工抗原。對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)

4、物采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行波峰掃描，根據(jù)其波峰的移動(dòng)，判斷其偶聯(lián)效果，并計(jì)算偶聯(lián)比率。選擇效果最好的偶聯(lián)方法大量制備抗原，并用于免疫BALB/c小鼠，通過直接ELISA的方法檢測多克隆抗體效價(jià)，用競爭抑制ELISA的方法分析其靈敏性及特異性。
　　結(jié)果:通過重氮法+碳二亞胺法偶聯(lián)的Dox人工完全抗原效果最好，經(jīng)計(jì)算其與BSA的偶聯(lián)比為8.37∶1，與OVA的偶聯(lián)比為4.92∶1。采用該方法偶聯(lián)的抗原免疫小鼠獲得的多抗效價(jià)在1∶800