共載阿霉素和三氧化二砷磁性氧化鐵顆粒作用淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Jurkat的體外研究.pdf

1、目的：為了克服阿霉素(ADM)明顯的全身毒性作用、提高三氧化二砷(As2O3)療效、尋找治療非霍奇金淋巴瘤的有效方法，提出一種新型磁靶向聯(lián)合藥物——共載ADM和As2O3的磁性納米二巰基丁二酸修飾的四氧化三鐵磁性納米顆粒(DMSA-Fe3O4 MNPs)ADM-As2O3 MNPs，既能提高治療靶向性、增加靶部位藥物濃度，又能實(shí)現(xiàn)兩種藥物協(xié)同作用增強(qiáng)療效減低毒副作用，為治療血液系統(tǒng)疾病的效果提供體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：

2、以B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji和T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat為研究對(duì)象，應(yīng)用ADM、As2O3、 ADM聯(lián)合As2O3及ADM-As2O3 MNPs處理上述細(xì)胞，觀察不同處理方法下細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，高分辨透射電鏡檢測(cè)納米顆粒在細(xì)胞中的定位和對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)ADM的累積量，熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)，RT-PCR和Western blotting分析檢測(cè)相關(guān)mRNA和蛋白的變

3、化，探討ADM聯(lián)合As2O3是否具有協(xié)同作用、磁性納米顆粒能否增強(qiáng)其協(xié)同作用、兩種不同來源的細(xì)胞對(duì)藥物的療效是否存在區(qū)別，并試圖闡明其中的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：1、對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji作用48 h時(shí)，ADM和As2O3對(duì)細(xì)胞的抑制作用均隨著濃度的增加而增強(qiáng)，空白MNPs對(duì)細(xì)胞無明顯抑制作用直到濃度高至80 mg/L時(shí)抑制率達(dá)20％以上，ADM聯(lián)合As2O3在有或無MNPs的情況下抑制率均明顯高于任何藥物單用時(shí)的抑制率，AD

4、M-As2O3 MNPs的抑制作用又比ADM聯(lián)合As2O3明顯;DMSA-Fe3O4呈類球形結(jié)構(gòu)，平均直徑約為18nm，鏡下視野內(nèi)分散性良好，MNPs作用細(xì)胞48 h后定位于細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)涵體中;ADM+As2O3組(21.35±1.29)％和ADM-As2O3 MNPs組(28.67±1.26)％的細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組和單藥組相比顯著提高，ADM-As2O3 MNPs組又高于ADM+As2O3組，DMSA-Fe3O4 MNPs組和對(duì)照組

5、無明顯差異;ADM-As2O3 MNPs能顯著提高細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度，ADM組（RFI6.2±0.2）與ADM+As2O3組（RFI6.33±0.28）的細(xì)胞內(nèi)累積的ADM類似，ADM-As2O3 MNPs組（RFI8.36±0.21）細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度高于其他組;ADM組、As2O3組、ADM+As2O3組及ADM-As2O3 MNPs組的細(xì)胞都呈現(xiàn)不同程度的凋亡細(xì)胞核典型特征，ADM-As2O3 MNPs組的較其他組更為明顯;ADM

6、+As2O3及ADM-As2O3 MNPs使bcl-2、NFκB和survivin的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)、bax、P53和caspase3的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，而ADM-As2O3 MNPs的調(diào)節(jié)幅度最大。
　　2、對(duì)于T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat，各實(shí)驗(yàn)組處理得到的結(jié)果與Raji細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)一樣，但敏感性有所區(qū)別:當(dāng)ADM濃度≥1 mg/L時(shí)，ADM對(duì)Jurkat細(xì)胞的抑制作用更快更高，而ADM低濃度時(shí)對(duì)Raji細(xì)胞的毒

7、性較明顯，As2O3濃度為4μM和16μM、作用48 h時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞的抑制率無明顯差別，而在作用24 h、48 h、72 h時(shí)、其他各濃度As2O3對(duì)Jurkat細(xì)胞的抑制作用均高于Raji細(xì)胞，當(dāng)DMSA-Fe3O4 MNPs為80 mg/L時(shí)，對(duì)Jurkat細(xì)胞較Raji細(xì)胞抑制作用更明顯，0.25 mg/L ADM+0.5μM As2O3和0.5 mg/L ADM+1μM As2O3作用Jurkat細(xì)胞和Raji細(xì)胞48 h，對(duì)J

8、urkat細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與單藥組比較抑制率均增加、有顯著差異，對(duì)Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率0.25 mg/L ADM+0.5μM As2O3較其ADM單藥組抑制率未見顯著增加，0.5 mg/L ADM+1μM As2O3較其單藥組有顯著差異，0.25 mg/L ADM-0.5 MAs2O340mg/L MNPs和0.5 mg/L ADM-1μM As2O340mg/L MNPs作用Jurkat細(xì)胞和Raji細(xì)胞48 h，對(duì)Raji細(xì)胞和

9、Jurkat細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與ADM+As2O3組比較均顯著增加，并且Jurkat細(xì)胞在與Raji細(xì)胞同樣配比濃度處理?xiàng)l件下，得到更高的細(xì)胞細(xì)胞抑制作用;Jurkat細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組得到更高的細(xì)胞早期凋亡率;Jurkat細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)顯示更高的ADM濃度;bcl-2、survivin、bax的mRNA在Jurkat細(xì)胞中比在Raji細(xì)胞中表達(dá)水平高，NFκB、P53的mRNA在Raji細(xì)胞比在Jurkat細(xì)胞中表達(dá)水平高，caspase

10、3 mRNA在兩種細(xì)胞中表達(dá)水平無顯著差別，bax、P53、caspase3的蛋白在Jurkat細(xì)胞中比在Raji細(xì)胞中表達(dá)水平高，NFκB、survivin的蛋白在Raji細(xì)胞比在Jurkat細(xì)胞中表達(dá)水平高，而bcl-2蛋白在兩種細(xì)胞中表達(dá)水平無顯著差別，ADM-As2O3 MNPs能顯著下調(diào)兩種細(xì)胞bcl-2、NFκB、survivin和上調(diào)bax、P53、caspase3的mRNA和蛋白水平，對(duì)Jurkat細(xì)胞的bax、P53、

11、caspase3蛋白上調(diào)率較Raji細(xì)胞低。
　　結(jié)論：1、ADM和As2O3能發(fā)揮協(xié)同作用增強(qiáng)對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Jurkat的細(xì)胞毒作用，通過下調(diào)bcl-2、NFκB、survivin的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)、上調(diào)bax、P53、caspase3的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。
　　2、ADM-As2O3 MNPs對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Jurkat的細(xì)胞毒和誘導(dǎo)凋亡作用較ADM聯(lián)合As2O3更強(qiáng)，磁性納米D