葫蘆素B單藥及與三氧化二砷合用的抗淋巴瘤作用研究.pdf

1、目的：
　　三氧化二砷(ATO)，是砒霜的重要組成成分，在中國已經(jīng)被使用了兩千多年。20世紀(jì)70年代 ATO被我國學(xué)者首先用于治療復(fù)發(fā)性和難治性急性早幼粒細(xì)胞性白血病( APL)。ATO是一個(gè)經(jīng)典的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，雖然在在急性早幼粒細(xì)胞白血病治療中療效顯著，但ATO在淋巴瘤中的治療作用仍然是有限的，這可能與淋巴瘤不恰當(dāng)?shù)男盘柾返募せ罴暗蛲瞿褪苡嘘P(guān)，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)及抗凋亡蛋白Bcl-2高表達(dá)等。以前的研究表明

2、葫蘆素B(CucurbitacinB， CuB)是一種有效的 STAT3抑制劑，在多種腫瘤中展現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)。Huang等研究顯示STAT3的激活與彌漫大B淋巴瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)。因此我們猜想，葫蘆素可以通過抑制STAT3磷酸化增強(qiáng)ATO在淋巴瘤中的作用，改善淋巴瘤的凋亡耐受。ATO和CuB的合用在淋巴瘤中至今還未被嘗試過。
　　結(jié)合相關(guān)研究背景和現(xiàn)狀，我們決定探索中藥栝樓對淋巴瘤細(xì)胞的作用，并探索其有效成分是否為CuB，

3、同時(shí)探索CuB是否可以在體內(nèi)外協(xié)同增強(qiáng)ATO的抗淋巴瘤作用。最后進(jìn)一步研究CuB聯(lián)合ATO抑制淋巴瘤的作用機(jī)制是否為CuB抑制了STAT3磷酸化。
　　材料與方法：
　　1.栝樓粗提物（TKE）對Burkitt’s淋巴瘤Ramos細(xì)胞增殖，凋亡和周期的影響：培養(yǎng)Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株Ramos細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞，分別加入不同濃度梯度的TKE培養(yǎng)48h，臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的TKE對兩種細(xì)胞增殖的影響；設(shè)

4、置不同濃度的TKE劑量組（2.5ug/ml TKE，5ug/ml TKE和空白對照組），F(xiàn)CM檢測Ramos細(xì)胞在0h，12h，24h的凋亡情況；FCM檢測Ramos細(xì)胞周期阻滯情況。
　　2.使用高效液相色譜指紋圖譜技術(shù)（HPLC）證實(shí)CuB是否為栝樓的有效成分。
　　3. CuB對Ramos細(xì)胞增殖及凋亡，周期的影響：培養(yǎng)Ramos細(xì)胞，加入不同濃度的CuB，臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖；FCM檢測48h后的細(xì)胞凋亡率和周

5、期分布。
　　4. CuB和ATO合用對淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響：傳代培養(yǎng)Ramos、G519兩種淋巴瘤細(xì)胞。設(shè)不同濃度藥物CuB（1,2.5,5 nmol/L）和ATO（0.5,1,2μmol/L）單用及合用組劑量組，共培養(yǎng)24小時(shí)，MTS法檢測CuB聯(lián)合ATO對兩種細(xì)胞增殖的影響。
　　5. CuB和ATO合用對淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響：傳代培養(yǎng)Ramos、G519兩種淋巴瘤細(xì)胞。每種細(xì)胞加入1 umol/L ATO和5 nmo

6、l/L CuB。FCM法檢測Ramos、G519兩種細(xì)胞的凋亡情況，Western blot檢測細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase8,9,3的變化。
　　6. CuB和ATO合用的抗腫瘤作用機(jī)制的研究：通過Western blot檢測了經(jīng)CuB和 ATO單獨(dú)及聯(lián)合處理后，Ramos細(xì)胞內(nèi)一些信號通路蛋白 P-STAT3、P-Erk1/2、bcl-2、Bax表達(dá)水平的變化。
　　7. CuB和ATO合用的體內(nèi)抗腫瘤作用研究：以Ram

7、os細(xì)胞注入裸鼠體內(nèi)建立淋巴瘤裸鼠移植瘤模型。設(shè)空白對照組，CuB單藥組，ATO單藥組，CuB與ATO合用組，給藥20天后處死小鼠，計(jì)算抑瘤率。免疫組化檢測PCNA，STAT3的表達(dá)情況；TUNEL法檢測淋巴瘤細(xì)胞原位凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.栝樓粗提物（TKE）對Burkitt’s淋巴瘤Ramos細(xì)胞增殖，凋亡，周期的影響
　　TKE能以時(shí)間與劑量依賴性的方式抑制Ramos細(xì)胞增殖；TKE明顯誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞

8、凋亡，在2.5μg/mL或5μg/mL TKE處理24 h后, TKE能以時(shí)間和劑量依賴性的方式誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞凋亡；在24 h時(shí),2.5和5μg/mL TKE組Ramos細(xì)胞的凋亡率的分別為33.93(±8.52)％,和71.33(±16.49)%(P<0.05)。通過凋亡檢測散點(diǎn)圖可以觀察到，在12 h和24 h之間，細(xì)胞呈現(xiàn)出一個(gè)明顯從早期凋亡到晚期凋亡的動態(tài)過渡。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，TKE能誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞組滯在G1期。

9、>　　2. CuB:栝樓是活性成分之一
　　通過分析，TKE在310 nm紫外線的保留時(shí)間是30.478s。高效液相色譜指紋圖譜顯示的CuB在310 nm的保留時(shí)間為30.395分鐘。因?yàn)楸Ａ魰r(shí)間的范圍的偏差在±2.5%，所以它可以證實(shí)，CuB是栝樓活性成分之一。
　　3.CuB對Burkitt淋巴瘤Ramos細(xì)胞增殖，凋亡，周期的影響
　　臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，2.5 nmol/ L和5 nmol/ L CuB

10、能呈時(shí)間和濃度依賴性地方式抑制Ramos細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡檢測的結(jié)果顯示CuB對Ramos細(xì)胞有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用。Ramos細(xì)胞的凋亡率在10 nmol/ L CuB處理后24 h高達(dá)64.4(±13.4)%(P<0.05)。細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖顯示24 h時(shí)，大量的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞晚期凋亡。在細(xì)胞周期檢測中，Ramos細(xì)胞經(jīng)10 nmol/ L CuB處理后顯示出S期阻滯。
　　4. CuB與ATO聯(lián)合應(yīng)用的體外抗淋巴瘤作用
　　

11、4.1.藥物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)果表明,低劑量的CuB與ATO聯(lián)合使用時(shí),CuB能以協(xié)同地方式大大增強(qiáng)了ATO對Ramos細(xì)胞的增殖抑制作用，但沒有提高ATO對G519細(xì)胞的影響。
　　4.2.細(xì)胞凋亡檢測顯示,聯(lián)合治療組(ATO+CuB)的細(xì)胞凋亡率高于CuB或ATO單獨(dú)作用。在G519細(xì)胞中，無明顯協(xié)同作用。Western blot結(jié)果顯示凋亡蛋白酶caspase8，9，3有明顯的裂解，表明CuB和ATO可同時(shí)通過內(nèi)源性和外源性凋亡通路誘

12、導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　4.3.在聯(lián)合作用機(jī)制上，Western blot顯示，經(jīng)CuB和ATO聯(lián)合處理后Ramos細(xì)胞內(nèi)P-STAT3和P-Erk1/2水平下降，總STAT3和Erk沒有顯著改變。進(jìn)一步檢測STAT3和Erk的下游靶標(biāo)水平，發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax上調(diào)。
　　5. CuB和ATO合用的體內(nèi)抗腫瘤作用
　　為了進(jìn)一步證實(shí)葫蘆素與ATO合用的抗淋巴瘤作用，Ramos淋巴瘤移植瘤模型被建

13、立。設(shè)立生理鹽水（NS）組，CuB單藥組，ATO單藥作用，CuB與ATO合用藥組。經(jīng)過20天腹腔給藥，結(jié)果顯示，CuB與ATO合用組瘤塊平均體積減小，小于對照組和 CuB和 ATO單用組。每組的平均瘤重為1.34±0.47g，1.20±0.69g，0.73±0.57g，0.25±0.22g，合用組抑瘤率達(dá)到85.6%。
　　結(jié)論：
　　1. CuB是栝樓的活性成分之一。
　　2. CuB在Burkitt’s淋巴瘤中具有