pEGFP-IRES-BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs移植治療大鼠脊髓損傷.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injuries,SCI)是現(xiàn)在交通、工礦事故、運動意外以及戰(zhàn)傷中常見的損傷,傷者多為青壯年,損傷造成的截癱不僅嚴重影響患者的身心健康,而且給家庭和社會造成巨大的經(jīng)濟、人力和精神負擔(dān)。長期以來脊髓損傷的修復(fù)一直是困擾人類健康的難題,也是世界各國科學(xué)家們致力于研究的焦點,但目前缺少切實可行的有效治療方法。 胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞和嗅鞘細胞移植是目前研究的熱點,但是都存在組織來源缺乏、倫理學(xué)及免疫排

2、斥等問題,而自體骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)移植可以解決上述問題。 BMSCs作為一種多潛能干細胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或外傷等造成的功能喪失治療作用顯著,具有與其它細胞來源無法比擬的優(yōu)勢：(1)獲取方便,可從患者本人骨髓取材；(2)可在體外快速培養(yǎng)擴增,并定向誘導(dǎo)分化；(3)在宿主組織中可長期生存并進行整合；(4)通過自體移植可避開免疫排斥反應(yīng)；(5)可進行基因工程技術(shù)加工；(6)能以多種途徑包括靜脈注射、中樞神經(jīng)損傷處不同部位

3、進行細胞移植。因此,BMSCs是一種理想的細胞來源,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞和基因治療提供了新的思路和廣闊前景。 腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)為神經(jīng)生長因子(NGF)家族的第二個成員。BDNF對多巴胺能神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元等多種神經(jīng)元都有廣泛作用,能促進干細胞更多的向神經(jīng)元樣細胞分化。局部注射神經(jīng)營養(yǎng)因子,有一定的危險性,并且不能長久維持較長時間的高濃度。全身靜脈

4、應(yīng)用,劑量必然需要大大增加,而中樞神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)的特殊性使外源性給藥利用率不高,同時由于局部微循環(huán)破壞而達不到治療濃度。這就要求采用一種能使神經(jīng)營養(yǎng)因子長久維持在損傷局部的高濃度釋放的方法。 BDNF基因轉(zhuǎn)染BMSCs,BMSCs可以反復(fù)傳代擴增,分泌大量的神經(jīng)生長因子,并且誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)系細胞分化,從而為脊髓損傷的干細胞移植治療及神經(jīng)營養(yǎng)因子基因治療探索一種新的切實可行的可能具有突破性的方法。 目的：

5、1、探討密度梯度離心和差速貼壁法對BMSCs的體外分離、純化、培養(yǎng),研究BMSCs的增殖、分化以及免疫學(xué)等生物學(xué)特性。 2、探索BDNF、GFP共表達質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染BMSCs方法,以及BMSCs-GFP、BMSCs-BDNF-GFP的生物學(xué)特性。 3、探討B(tài)MSCs、BMSCs-GFP、BMSCs-BDNF-GFP與DRG經(jīng)Transwell共培養(yǎng)的方法,及對DRG軸突生長的促進作用。 4、評價BMSCs-BD

6、NF-GFP移植治療大鼠脊髓損傷的作用。 方法： 第一部分選用6周齡SD大鼠,采用Ficoll分離液密度梯度離心法獲取骨髓中的BMSCs,通過反復(fù)傳代培養(yǎng)差速貼壁法使之純化,獲得的細胞純度高,生物性狀穩(wěn)定,增殖能力強的細胞株。并重點地觀察了BMSCs形態(tài)變化、細胞活性、細胞生長曲線、表面免疫標(biāo)記物檢測以及細胞的成骨誘導(dǎo)分化能力等。 第二部分主要研究從大鼠胎腦組織中獲取BDNF序列,構(gòu)建BDNF和GFP共表達重組質(zhì)

7、粒pEGFP-IRES2-BDNF,lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染BMSCs,獲得同時穩(wěn)定高效表達BDNF和GFP的BMSCs-BDNF-EGFP。ELISA等方法研究BMSCs-BDNF-EGFP的生物學(xué)特性。 第三部分取孕期14d的胎鼠的背根神經(jīng)節(jié),建立體外胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)的分離培養(yǎng)及純化體系,并通過0.40μm的Transwell小室胎鼠行DRG與BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EG

8、FP共培養(yǎng),通過倒置相差顯微鏡及免疫組化觀察其對DRG軸突生長的促進作用,驗證細胞活性。 第四部分動物分組和損傷模型的制備及處理：制備大鼠脊髓半切損傷動物模型,分別行生理鹽水、BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP移植。實驗結(jié)果的觀測：(1)行為學(xué)觀測:BBB評分；(2)動物灌注,脊髓切片；(3)免疫組織化學(xué)分析(4)BDA順行追蹤。統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果： 1、密度梯度離心和差速貼壁法分離

9、純化的BMSCs經(jīng)生物學(xué)及流式細胞儀表面標(biāo)記物鑒定,活細胞率為95～100％,純度99％；誘導(dǎo)培養(yǎng)后堿性磷酸酶染色陽性,鈣結(jié)節(jié)染色陽性。 2、成功構(gòu)建BDNF和GFP共表達質(zhì)粒,并成功轉(zhuǎn)染BMSCs,獲得的BMSCs-BDNF-EGFP增強表達BDNF,是正常細胞的20,000倍。 3、胎鼠的DRG通過Transwell培養(yǎng)板與BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP共培養(yǎng),BMSCs、BMSCs

10、-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP促進DRG的軸突生長,BMSCs-BDNF-EGFP更明顯。 4、BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP促進大鼠脊髓損傷的修復(fù),BMSCs-BDNF-EGFP效果更顯著。 結(jié)論： 1、密度梯度離心和差速貼壁法是一種很好的分離純化BMSCs的方法。 2、pEGFP-IRES2-BDNF使BDNF和GFP兩個基因在一個載體中的同一個啟動子下協(xié)