SDF-1引導膜協(xié)同BMP-2促進CXCR4+-BMSCs修復大段骨缺損的研究.pdf

1、目的：
　　(1)驗證介導 CXCR4的慢病毒轉染骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)后 BMSCs表達 CXCR4增加;(2)檢測CXCR4+-BMSCs向基質細胞衍生因子l(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)的定向趨化能力;(3)構建SDF-1/I型膠原/殼聚糖復合膜，檢測膜的表征、溶脹率、生物相容性、緩控釋放SDF-1；(4

2、)構建山羊脛骨缺損模型，通過將SDF-1/I型膠原/殼聚糖復合膜復合于組織工程骨中，觀察結合CXCR4+-BMSCs及BMP-2促進大段骨缺損修復的效果，為最終治療大段骨缺損提供一種治療上的可能。
　　方法：
　　(1)全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)山羊BMSCs，并通過成骨、成脂、成軟骨多方誘導，并進行相應染色鑒定;從形態(tài)學角度觀察細胞形態(tài)，活死細胞染色液染色傳三代細胞，DAPI液染色細胞核；將介導CXCR4的慢病毒載體轉染BMSC

3、s，并通過熒光及蛋白的表達來驗證轉染效果;(2)通過 Transwell實驗來驗證CXCR4+-BMSCs向 SDF-1趨化能力強于 BMSCs；(3)利用冷凍干燥法制備SDF-1/I型膠原/殼聚糖引導膜，通過掃描電鏡觀察其表征并檢測溶脹率；使用含有溶酶菌的PBS液模仿體內酶降解生物膜，用ELISA試劑盒檢測不同時間點的SDF-1濃度；用MTS法檢測SDF-1引導膜對三組細胞增殖、分化的影響；(4)采用介入微循環(huán)系統(tǒng)構建山羊脛骨大段骨缺

4、損模型，并利用此動物模型，給予灌注CXCR4+-BMSCs及BMP治療，觀察山羊一般情況并利用影像學觀測脛骨修復的變化。(5)數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準差，采用SPSS19.0軟件分析統(tǒng)計，組間兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，各組間差異使用單因素方差分析，p<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　(1)BMSCs在活死細胞染色液染色后全部呈現(xiàn)良好活性，綠色熒光強，DAPI染色后的細胞核形態(tài)良好，未見明

5、顯凋亡，CXCR4基因轉染的傳三代BMSCs表達CXCR4水平較轉染前明顯升高；(2)Transwell實驗表明CXCR4+-BMSCs對SDF-l的趨化能力比BMSCs明顯升高(p<0.05)；(3)成功制備SDF-1/I型膠原/殼聚糖復合膜，復合膜呈疏松多孔的海綿狀，溶脹率98％，平均孔徑分別為(131±12)um;復合膜在含溶菌酶的PBS中可緩慢而持久地釋放SDF-1；復合膜用于培養(yǎng)BMSCs，可以保持細胞增殖狀態(tài)，電鏡及能譜掃描

6、下可觀察到增殖分裂的細胞；(4)成功構建介入微循環(huán)系統(tǒng)修復山羊脛骨大段骨缺損模型，山羊行走、奔跑功能恢復良好，影像學可見上下骨痂相連緊密，組織工程骨大部分吸收。
　　結論：
　　(1)介導CXCR4的慢病毒載體能順利轉染通過全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)的山羊BMSC，使其CXCR4過表達,并明顯提高CXCR4+-BMSCs向SDF-1趨化的能力；(2)SDF-1/I型膠原/殼聚糖復合膜可體外降解并緩慢釋放SDF-1,生物相容性良好；