發(fā)形霞水母觸手提取物對(duì)大鼠離體心臟作用及其延遲毒性效應(yīng).pdf

1、背景和目的
　　 近年來(lái)，水母爆發(fā)和水母蜇傷事件日益頻繁，給海濱旅游業(yè)、近海漁業(yè)及水下作業(yè)帶來(lái)極大的危害，全世界每年被水母蟄傷的患者數(shù)以十萬(wàn)計(jì)，死者不在少數(shù)。水母蜇傷后絕大部分情況下會(huì)產(chǎn)生皮膚瘙癢、刺痛、紅腫等局部癥狀，嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致呼吸、循環(huán)衰竭甚至死亡。
　　 水母毒素是一類肽類毒素，具有溶血、神經(jīng)、肌肉、呼吸、循環(huán)以及皮膚壞死等多種生物毒性。心血管毒性是水母蜇傷的主要毒性之一，被認(rèn)為是水母蜇傷致死的主要原因。水母毒

2、素研究從20世紀(jì)60年代起在水母危害最嚴(yán)重的澳大利亞就已經(jīng)受到關(guān)注和重視，研究發(fā)現(xiàn)Chironex fleckeri、Chrysaora quinquecirrha、Chiropsalmus quadrigatus等從水母觸手中提取的刺絲囊毒素(nematocyst venom，NV)含有強(qiáng)烈的心血管毒性。由于NV含量極少，在提取和使用過(guò)程中其心血管毒性喪失明顯，而各實(shí)驗(yàn)室毒素提取方法又各不相同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果差異很大，甚至有相互矛盾

3、之處。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)觸手提取物(tentacle-only extract，TOE)與NV都具有明顯的心臟毒性和細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)中用易于獲得的TOE代替NV對(duì)水母毒素研究具有重要促進(jìn)作用。
　　 前期研究表明，C.capillata TOE對(duì)麻醉大鼠產(chǎn)生一個(gè)輕度而短暫的升血壓反應(yīng)后伴隨劇烈的血壓下降，直至循環(huán)衰竭而死亡。但TOE所引起的心血管毒性主要是全身神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的結(jié)果還是直

4、接作用于心臟所致，僅在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究層面，難以明確回答，且目前缺少水母毒素對(duì)離體心臟的影響及其機(jī)理的系統(tǒng)研究。因此，本課題第一部分采用Langendorff離體心臟灌注模型，盡量排除神經(jīng)體液因素的影響，研究C.capillata TOE對(duì)大鼠離體心臟的影響。
　　 另外，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠尾靜脈注射TOE研究其半數(shù)致死劑量LD50過(guò)程中，通過(guò)血生化指標(biāo)及血?dú)夥治鼋Y(jié)果，發(fā)現(xiàn)數(shù)分鐘至2h內(nèi)急性死亡的小鼠死因主要是急性心臟或

5、神經(jīng)相關(guān)毒性；而2h至2天內(nèi)死亡的小鼠因除心臟受到毒素?fù)p傷外，肝腎也明顯受損，其死因目前尚不明確。因此，相對(duì)于數(shù)分鐘至2h內(nèi)水母毒素所致的以心血管毒性、神經(jīng)毒性等為主的急性毒性反應(yīng)，2h～48h內(nèi)由水母毒素引發(fā)的以全身性多器官損傷為主的一系列臨床表現(xiàn)，我們稱之為水母蜇傷遲發(fā)綜合征或者水母毒素延遲毒性綜合征。水母毒素延遲毒性作用機(jī)理未見(jiàn)報(bào)道，而這種研究相對(duì)于水母急性毒性更具有臨床實(shí)際意義，因多數(shù)臨床上的水母蜇傷患者急性致死者的較少見(jiàn)，多數(shù)

6、的受傷中毒者儀發(fā)生局部反應(yīng)，但也有部分中毒者由于救治的時(shí)機(jī)的延誤或者致傷水母不同、中毒劑量不同可能發(fā)生水母蜇傷遲發(fā)綜合征。因此，本課題第二部分?jǐn)M通過(guò)建立TOE延遲毒性作用模型，研究水母毒素延遲毒性的效應(yīng)及作用機(jī)理。
　　 研究方法
　　 第一部分：TOE對(duì)離體心臟作用。提取C.capillata TOE樣品，并用KH液(pH7.35～7.45)透析。麻醉大鼠，開胸取心并懸掛于離體心臟灌流系統(tǒng)，左心室插入球囊以記錄左心室壓

7、，側(cè)管推注給予不同劑量TOE，觀察30min，全程監(jiān)測(cè)HR、LNDP、INEDP、dp/dt以及CF等指標(biāo)，連接心電導(dǎo)聯(lián)記錄大鼠離體心臟ECG，分析TOE對(duì)大鼠離體心臟心功能以及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的影響。取TOE作用后的大鼠離體心臟，4％甲醛固定，常規(guī)病理檢查；取TOE作用后的大鼠離體心臟，4％多聚甲醛固定，透射電鏡觀察TOE對(duì)心肌的影響。按上述方法分離、提取C.capillata TOE樣品，采用堿變性以及緩沖液更換等方法制備去除溶血組分的

8、TOE。使用前采用KH液(pH7.35～7.45)透析。麻醉大鼠，開胸取心并懸掛于離體心臟灌流系統(tǒng)，左心室插入球囊以記錄左心室壓，側(cè)管推注去溶血組分的TOE 0.3mg，觀察30min，全程監(jiān)測(cè)HR、LVDP、LVEDP、dp/dt以及CF等指標(biāo)，連接心電導(dǎo)聯(lián)記錄大鼠離體心臟ECG。取TOE作用后的SD大鼠離體心臟，4％甲醛固定，常規(guī)病理檢查及透射電鏡觀察TOE對(duì)心肌的影響。分析TOE與去溶血組分的TOE對(duì)大鼠離體心臟影響的異同。

9、>　　 第二部分：TOE的延遲毒性作用機(jī)理。將大鼠放入ALC-HTP動(dòng)物恒溫固定器內(nèi)，露出鼠尾，測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓(Systolic blood pressures，SBP)。在測(cè)量前，利用恒溫系統(tǒng)加熱2-5min，溫度設(shè)置在33-34℃使大鼠尾動(dòng)脈充分?jǐn)U張，易于信號(hào)傳導(dǎo)。通過(guò)大鼠尾靜脈注入0.2mL/100g的TOE，濃度分別為0μg/kg，90μg/kg，180μg/kg，360μg/kg，540μg/kg以及實(shí)驗(yàn)對(duì)照(360μg/

10、kg的TOE經(jīng)煮沸10min滅活)。記錄注射TOE后0.2h，2h，4h，6h，8h和10h的SBP，持續(xù)觀察10h，并記錄死亡時(shí)間。注射TOE10h后，將大鼠以25％烏拉坦腹腔麻醉(1.0mg/kg)后，取腹主動(dòng)脈血液檢測(cè)血生化指標(biāo)。檢測(cè)指標(biāo)包括血常規(guī)，肝功能指標(biāo)(TP、ALB、Glob、A/G、ALT、AST、LDH)，腎功能指標(biāo)(Urea、Crea)，心肌酶譜(CK、CK-MB)，血電解質(zhì)(Na+、K+、Ca2+和Cl-)。取空白

11、對(duì)照組及高劑量組心、肺、肝及腎等器官，常規(guī)病理檢查和透射電鏡觀察，同時(shí)采用TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果
　　 第一部分：TOE對(duì)大鼠離體心臟作用。給予TOE后，SD大鼠離體心臟HR、LVDP、dp/dt及CF各項(xiàng)心功能指數(shù)呈劑量依賴性下降，而LVEDP則呈劑量依賴性上升。病理學(xué)檢查顯示部分心肌纖維變性。透射電鏡顯示部分心肌纖維斷裂、溶解、消失，線粒體發(fā)生腫脹，少量線粒體內(nèi)部脊結(jié)構(gòu)不清晰，遭到破壞。生化分析顯示

12、LDH、AST、CK、CK-MB等酶指標(biāo)顯著升高，提示心肌細(xì)胞受到破壞。此外，由導(dǎo)出的ECG發(fā)現(xiàn)，TOE能夠誘發(fā)離體心臟的心律失常，并具有劑量依賴性，當(dāng)TOE0.5mg時(shí)，可誘發(fā)Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯。
　　 經(jīng)過(guò)堿變性、緩沖液透析，得到去除溶血活性的TOE組分，去溶血活性的TOE組分相對(duì)于TOE對(duì)離體心臟心電圖影響并不明顯，卻仍然能夠使HR、LVDP、dp/dt及CF各項(xiàng)心功能指數(shù)呈劑量依賴性下降，LVEDP呈劑量依賴性上升，但作用

13、均較TOE輕微。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，去溶血組分TOE作用過(guò)的離體心臟，可見(jiàn)心肌纖維變性。
　　 第二部分：TOE的延遲毒性作用機(jī)理。在給予不同劑量(90μg/kg、180μg/kg、360μg/kg)的TOE后，觀察10h內(nèi)TOE對(duì)大鼠無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈壓影響。在給予最高的劑量(540μg/kg)后，三個(gè)劑量組的大鼠均存活，各劑量組的的大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)同對(duì)照組(360μg/kg的TOE經(jīng)煮沸滅活后)相比，高、中、低三個(gè)劑量組SBP

14、均呈現(xiàn)先升高，后降低的過(guò)程，且呈劑量依賴性。
　　 各臟器損傷程度隨TOE劑量的增加而加重，且呈現(xiàn)劑量依賴性。在給予TOE10h后，在各劑量組中，肝腎功能相關(guān)生化指標(biāo)及酶學(xué)指標(biāo)變化均提示肝腎功能受損。心肌損傷酶學(xué)指標(biāo)只在高劑量組呈現(xiàn)明顯上升。血電解質(zhì)指標(biāo)中K+濃度升高和Cl-濃度下降在中高劑量組呈現(xiàn)出顯著變化，而Ca2+濃度升高而Na+濃度下降則只在高劑量組表現(xiàn)出明顯差異。
　　 病理結(jié)果顯示肝腎損傷隨TOE劑量增加而加

15、重，在中高劑量組以肝細(xì)胞大片壞死，腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，管腔內(nèi)充滿大量壞死細(xì)胞碎片和透明管型。心臟損傷相對(duì)較輕，主要是心肌細(xì)胞變性，心肌纖維扭曲，并伴有間質(zhì)水腫。除部分肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)散在出血及輕微的組織液滲出，肺臟無(wú)明顯損傷。
　　 在TUNEL和透射電鏡檢測(cè)中，可見(jiàn)肝腎組織內(nèi)大量的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)損傷；心臟組織內(nèi)沒(méi)有觀察到明顯凋亡細(xì)胞，而細(xì)胞內(nèi)損傷相對(duì)肝。腎組織較輕；肺臟只有局部凋亡細(xì)胞。
　　 結(jié)論
　　 C

16、.capillata TOE具有心臟毒性，可直接作用于心臟的心肌及傳導(dǎo)系統(tǒng)，而水母毒素中，溶血活性等其他活性組分在TOE心臟毒性效應(yīng)的發(fā)揮中起重要輔助作用。當(dāng)TOE劑量為0.1mg、0.2mg時(shí)，可導(dǎo)致離體心臟心功能下降，但會(huì)有一定程度的恢復(fù)：然而，當(dāng)TOE劑量達(dá)到0.3mg及以上時(shí)，心功能發(fā)生不可恢復(fù)的下降。此外，TOE可導(dǎo)致心肌纖維溶解、斷裂，線粒體腫脹等病理性變化，相關(guān)心肌酶譜分析也顯示心肌細(xì)胞受到了一定程度的損傷。TOE對(duì)心臟的

17、傳導(dǎo)系統(tǒng)也具有毒性作用，可誘發(fā)不同程度的心律失常，并具有劑量依賴性。當(dāng)TOE劑量達(dá)到0.5mg時(shí)，可誘發(fā)Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯。
　　 通過(guò)給予大鼠尾靜脈注入不同劑量的發(fā)形霞水母觸手提取物(TOE)，成功模擬了水母毒素延遲毒性綜合征的動(dòng)物模型，可以觀察到明顯的劑量依賴性反應(yīng)。綜合病理及TUNEL等各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得出水母毒素延遲毒性主要引發(fā)嚴(yán)重的肝、腎損傷，而心肺損傷相對(duì)較輕。這同以心臟毒性、神經(jīng)毒性為主要表現(xiàn)的急性毒性作用之間存在明

18、顯的差異?？赡茉蛑饕嵌舅貏┝康牟顒e。即大劑量水母毒素中毒后，在開始的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)可出現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)塌陷、心臟驟停甚至死亡或者通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用，導(dǎo)致呼吸困難甚至驟停。然而，低劑量的毒素則在數(shù)小時(shí)后可能導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死引發(fā)的急性肝臟功能衰竭或者腎小管細(xì)胞壞死引發(fā)的急性腎功能衰竭。
　　 在上述實(shí)驗(yàn)中，在給予TOE后相當(dāng)時(shí)間內(nèi)(0.2～4h)產(chǎn)生一個(gè)明顯的升血壓效應(yīng)，其中一個(gè)可能原因是經(jīng)部分研究證實(shí)的水母毒素引起的縮血管效應(yīng)，也可能是