血管內(nèi)皮細(xì)胞抗發(fā)形霞水母觸手提取物縮血管反應(yīng)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　探討血管內(nèi)皮細(xì)胞( vascular endothelial cells, VECs)在抗發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)觸手提取物(tentacle extract,TE)縮血管反應(yīng)中的保護(hù)作用,為防治C.capillata蜇傷提供新思路和新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1、驗(yàn)證TE對人奇靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)的毒

2、性作用:
　　1.1 MTT法測細(xì)胞存活率:收集我國沿海C. capillata并經(jīng)鑒定后提取C. capillata TE樣品。①以濃度梯度為控制因素,加入不同濃度(0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml)TE孵育細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml的HUVEC細(xì)胞6h,MTT法檢測經(jīng)HUV

3、EC細(xì)胞的存活率。②另一方面以不同濃度(1μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)TE不同時(shí)間(6h,12h,24h,48h)孵育細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml的HUVEC細(xì)胞,MTT法檢測HUVEC細(xì)胞的存活率。
　　1.2流式細(xì)胞術(shù)測TE作用后HUVEC細(xì)胞凋亡壞死:加入不同濃度(0μg/ml、1μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)TE處理HUVEC細(xì)胞6h后,采用流式細(xì)胞分析檢測HU

4、VEC細(xì)胞的凋亡。
　　2、血管舒縮因子前列環(huán)素(Prostacyclin,PGI2)、血栓素(Thromboxane, TXA2)、血管緊張素(AngiotensinⅡ,AngⅡ)含量檢測:
　　2.1加入不同濃度TE(0μg/ml,1μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)作用HUVEC細(xì)胞6h,采用ELISA檢測不同濃度TE作用HUVEC細(xì)胞后分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。
　　2.2濃度為5μg/

5、ml TE加入HUVEC細(xì)胞后,分別作用0min、5min、30min、2h、6h、12h后,采用ELISA檢測TE不同孵育時(shí)間HUVEC細(xì)胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。
　　3、觀察SD大鼠股動(dòng)脈血壓(Blood pressure,BP)變化:
　　SD大鼠(280~320g)麻醉后,行股主動(dòng)脈插管及頸靜脈插管法,分別予①對照組(0.9％生理鹽水組);②1.4mg/ml TE組;③10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑

6、(吲哚美辛)+1.4mg/ml TE組;④10μmol/L血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(卡托普利)+1.4mg/ml TE組藥物干預(yù)。觀察1h內(nèi)股動(dòng)脈BP的變化情況,以明確藥物干預(yù)效果及VECs在TE縮血管毒性過程中的保護(hù)作用,并為臨床治療水母蜇傷篩選出有效的治療藥物。
　　4、SD大鼠心臟、腎臟功能的影響:
　　在整體動(dòng)物檢測BP變化情況實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,迅速從股動(dòng)脈插管處抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈血,檢測心肌酶、腎功能(LDH、CK、sCr及

7、BUN)。
　　結(jié)果:
　　1、TE對HUVEC細(xì)胞存活率的影響:
　　①當(dāng)TE濃度小于2.5μg/ml時(shí),HUVEC細(xì)胞存活率為100%,細(xì)胞活性與正常對照組(TE濃度0μg/ml)相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);當(dāng)TE濃度大于5μg/ml時(shí),HUVEC細(xì)胞開始出現(xiàn)死亡,TE濃度為5μg/ml時(shí)細(xì)胞存活率為97.55%,TE濃度為10μg/ml時(shí)細(xì)胞存活率為50%,當(dāng)TE濃度為320μg/ml時(shí)HUVEC細(xì)胞已

8、幾乎全部死亡,細(xì)胞存活率僅為4.83%,以上結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此在濃度為5~320μg/ml范圍內(nèi)時(shí)TE對HUVEC細(xì)胞的毒性作用具有濃度依賴性,隨著TE濃度的增加其對HUVEC細(xì)胞毒性增強(qiáng)。
　?、谕粷舛萒E隨著預(yù)孵時(shí)間的延長,對HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用不斷增強(qiáng),TE的毒性作用具有時(shí)間依賴性(P<0.05);當(dāng)TE濃度為1μg/ml時(shí),分別預(yù)孵HUVEC細(xì)胞6h和12h可見細(xì)胞存活率大于100%,由此可知TE在低濃度(

9、≤1μg/ml)短時(shí)間(≤12h)內(nèi)對HUVEC細(xì)胞具有促生長的作用,當(dāng)TE濃度為2.5μg/ml時(shí),預(yù)孵6h時(shí)細(xì)胞存活率100%,TE濃度為5μg/ml時(shí),預(yù)孵6h時(shí)細(xì)胞開始出現(xiàn)死亡,TE濃度10μg/ml時(shí)HUVEC細(xì)胞大量死亡,細(xì)胞存活率小于50%(P<0.05)。
　　由以上實(shí)驗(yàn)可知,濃度為5μg/ml的C.capillata TE預(yù)孵HUVEC細(xì)胞6h可引起細(xì)胞死亡,因此選擇濃度為5μg/ml的TE做后續(xù)的實(shí)驗(yàn);10μg

10、/mlTE預(yù)孵6h可引起細(xì)胞明顯死亡。
　　2、TE致HUVEC細(xì)胞凋亡與壞死:
　　TE濃度在1~10μg/ml濃度時(shí),導(dǎo)致的細(xì)胞壞死不明顯(P>0.05),在1μg/ml和2.5μg/ml濃度時(shí)TE導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡尚不明顯(P>0.05),當(dāng)TE濃度5μg/ml時(shí)可有部分細(xì)胞凋亡,當(dāng)TE濃度10μg/ml時(shí)可有大量細(xì)胞凋亡(P<0.05)。
　　3、血管舒縮因子PGI2、TXA2、AngⅡ含量檢測:
　　①PG

11、I2隨TE作用濃度增加分泌量逐漸增大,TXA2隨TE作用濃度增加分泌量無明顯變化,PGI2/TXA2隨TE作用濃度增大比值增大,AngⅡ隨TE濃度增大分泌量增大,以上結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故HUVEC細(xì)胞分泌的PGI2、AngⅡ及PGI2/TXA2比值在TE作用下可發(fā)生變化,且具有劑量依賴性,隨TE濃度增大而增大。
　?、赥E(5μg/ml)預(yù)孵HUVEC細(xì)胞一定時(shí)間內(nèi)(0min~12h)可引起HUVEC細(xì)胞舒縮因子PGI2、TXA

12、2、AngⅡ分泌量改變,PGI2隨著TE刺激時(shí)間的延長分泌量逐漸增加,5min時(shí)分泌量達(dá)高峰,6h分泌量開始下降,但分泌量仍高于正常水平,12h與6h分泌量無明顯差別;TXA2隨著TE刺激時(shí)間的增加分泌量逐漸增高,在6h到達(dá)高峰,12h與6h分泌量無明顯差別; AngⅡ在5min分泌量仍高于正常水平,在2h達(dá)最高值,6h分泌量又下降,但分泌量仍高于正常水平,分泌量6h與12h分泌量無明顯差別,以上結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、S

13、D大鼠股動(dòng)脈BP變化
　　在觀察時(shí)間(60min)內(nèi),與對照組(0.9%生理鹽水組)相比,1.4mg/ml TE組SD大鼠股動(dòng)脈BP在前10min內(nèi)明顯下降,10min時(shí)達(dá)最低值,后逐漸升高,60min時(shí)恢復(fù)至起始BP水平,整個(gè)觀察時(shí)間內(nèi)BP平均值均低于對照組;10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑(吲哚美辛)+1.4mg/ml TE組在觀察時(shí)間內(nèi)BP值較對照組無明顯變化;10μmol/L血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(卡托普利)+1.4mg/m

14、l TE組在前10min內(nèi)BP先下降后升高,在20~30min內(nèi)恢復(fù)至對照組水平,后BP繼續(xù)升高,且高于對照組,以上結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、SD大鼠心、腎功能檢測:
　　在整體動(dòng)物股動(dòng)脈BP監(jiān)測實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,從股動(dòng)脈抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈血,低溫超速離心后取上清,行血生化檢測結(jié)果顯示與對照組(0.9%生理鹽水組)相比,1.4mg/ml TE組SD大鼠心肌酶譜(LDH、CK)明顯升高,腎功能(sCr、BUN)嚴(yán)重?fù)p害;10μm

15、ol/L環(huán)氧合酶抑制劑(吲哚美辛)+1.4mg/ml TE組、10μmol/L血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(卡托普利)+1.4mg/ml TE組心肌酶(LDH、CK)升高較1.4mg/ml TE組低,腎功能(sCr、BUN)損害較較1.4mg/ml TE組輕,以上結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.證明了TE對HUVEC細(xì)胞有直接的毒性作用,一定濃度TE及預(yù)孵時(shí)間可導(dǎo)致HUVEC細(xì)胞壞死與凋亡,降低細(xì)胞存活率。