NK細胞在SIV-SHIV感染猴腸道粘膜炎癥反應(yīng)和細菌移位中的作用機制探討.pdf

1、由于腸道固有層富含高表達CCR5的CD4+T細胞，腸道粘膜系統(tǒng)成為HIV/SIV的入侵部位、主要復(fù)制和藏匿場所。研究表明，病毒的入侵感染以及粘膜微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞極易引發(fā)腸道粘膜炎癥反應(yīng)。同時，HIV/SIV感染對腸道粘膜屏障持續(xù)破壞，容易導(dǎo)致宿主發(fā)生細菌移位，造成內(nèi)毒素血癥。炎癥反應(yīng)和細菌移位的發(fā)生都會引起機體免疫系統(tǒng)的進一步激活，艾滋病毒的持續(xù)感染致使機體免疫系統(tǒng)逐漸耗竭，加速疾病進程的同時極大地增大了機會性感染的發(fā)生概率。自然殺傷細

2、胞(NK細胞)作為天然免疫系統(tǒng)的重要組分，其在抗HIV/SIV感染中的重要作用已經(jīng)被諸多文獻證實，但研究多集中在外周循環(huán)，其在粘膜部位的抗艾滋病感染免疫機制尚缺乏相關(guān)研究。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)一群特殊的NK細胞—NKp44+NK細胞，其定位分布于粘膜部位，主要通過分泌IL-22發(fā)揮粘膜保護作用。因此，本研究主要針對粘膜NK細胞亞群在艾滋病感染腸道炎癥反應(yīng)和細菌移位中的作用機制進行探討。
　　 本研究首先探索經(jīng)典NK細胞和NKp44

3、+NK細胞在SIV急性感染期的抗病毒和粘膜保護作用機制。選用正常中國恒河猴，分別在SIVmac239感染早期的不同時間點手術(shù)或安樂取腸道粘膜組織，進行粘膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associatedlymphoidtissues，MALTs)淋巴細胞的分離和各項指標(biāo)的檢測工作，同時結(jié)合動物病毒感染進程和免疫系統(tǒng)的各種變化趨勢，分析腸道粘膜部位NK細胞在艾滋病毒早期感染中的主要作用機制。結(jié)果顯示，經(jīng)靜脈途徑接種的SIV病毒能迅速擴散至

4、腸道粘膜部位，并進行高水平復(fù)制，同時造成CD4+T細胞數(shù)量大幅度減少。此外，SIV感染急性期MALTsCD56-CD16+NK細胞亞群比例增幅明顯，同時細胞毒性功能增強；CD56-CD16-NK細胞亞群數(shù)量減少，功能無明顯變化；CD56+CD16+和CD56+CD16-NK細胞數(shù)量比例略有增加趨勢，但免疫調(diào)節(jié)功能顯著降低。這些變化趨勢揭示，粘膜部位NK細胞通過增強脫顆粒作用發(fā)揮積極的殺傷病毒感染靶細胞作用。此外，腸組織中炎癥因子IL-1

5、0水平在感染后一周內(nèi)出現(xiàn)明顯的增高波動峰，說明病毒感染引起了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在SIV感染一周內(nèi)，腸道粘膜NKp44+NK細胞數(shù)量比例呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，同時隨著感染時間的增加其產(chǎn)生IL-22水平逐漸增強。表明SIV感染早期雖有炎癥反應(yīng)發(fā)生，但NKp44+NK細胞通過數(shù)量擴增和增加IL-22的分泌降低炎癥反應(yīng)，在維持粘膜正常屏障功能和穩(wěn)態(tài)平衡起到了積極作用。
　　 其次，為進一步探索艾滋病慢性感染期NK細胞在腸道細菌移位發(fā)生中的作

6、用，本研究通過血漿細菌內(nèi)毒素水平和血常規(guī)指標(biāo)，將SHIV-1157ipd3N4慢性感染動物分為LPShigh和LPSlow兩組，對兩組動物外周、粘膜系統(tǒng)的經(jīng)典NK細胞和NK-22細胞亞群數(shù)量和功能變化作了對比分析。結(jié)果表明，在SHIV慢性感染期，血漿內(nèi)毒素水平的高低與SHIV病毒在外周和粘膜部位的復(fù)制水平無直接關(guān)系，但直腸途徑感染可能會增加動物細菌移位發(fā)生概率。內(nèi)毒素血癥促進T細胞的進一步激活，表現(xiàn)為病毒對CD4+T細胞的進一步損毀和C

7、D8+T細胞的增殖。NKp44+NK細胞慢性感染期數(shù)量減少，且產(chǎn)生IL-22的水平明顯較低，該群細胞粘膜保護功能異?？赡苁窃斐杉毦莆坏脑蛑?；發(fā)生細菌移位動物粘膜NKp44+NK細胞脫顆粒殺傷能力有所增強，但這種功能潛能的轉(zhuǎn)變并不能對細菌移位產(chǎn)生積極作用。所以，NKp44+NK細胞正常粘膜保護作用的發(fā)揮對于降低細菌移位發(fā)生概率，維持粘膜完整性和穩(wěn)態(tài)平衡具有重要意義。SHIV慢性感染期經(jīng)典NK細胞功能出現(xiàn)缺陷，細菌移位可能使其活化程度

8、增高，但卻不能發(fā)揮正?？垢腥竟δ?。因此，艾滋病慢性感染期，粘膜免疫功能的缺陷和異?？赡苁窃斐杉毦莆话l(fā)生的重要因素。此外，漿細胞分泌IgA等抗體能力也可能是影響細菌移位發(fā)生的重要免疫因素。
　　 最后，為準(zhǔn)確檢測艾滋病猴模型特異性細胞免疫，優(yōu)化、確定胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)影響因素和條件。本研究使用三種多克隆激活劑分別刺激SIV感染猴外周血單個核細胞(PBMC)，確定最佳陽性刺激物和刺激時間；然后使用五種濃度SIVmac239

9、混合肽庫分別刺激SIV感染猴PBMC，體外培養(yǎng)，不同時間點進行細胞染色和流式檢測，確定肽庫的最適刺激濃度和最佳刺激時間。最后，初步應(yīng)用該方法檢測SIV感染猴細胞免疫水平。最終結(jié)果確定PMA+離子霉素組合可用作本實驗的陽性刺激物；2μg/mL肽庫,37℃5％CO2培養(yǎng)16h，能更有效的刺激T細胞分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ。該方法的優(yōu)化對艾滋病藥物的臨床前評價和疫苗研發(fā)等研究具有重要意義。
　　 因此，經(jīng)典NK細胞和NKp