白血病新融合基因PAX5-UBE2D4的克隆及功能研究.pdf

1、目的:1.檢測65例初診急性B淋巴細(xì)胞白血病及19例染色體核型分析為9p13異常患者中PAX5基因重排的發(fā)生率,并分析其臨床特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)室特征。2.從一例伴dic(7;9)(p11-13;p13)的混合表型急性白血病的研究入手,定位克隆PAX5的新對手基因及融合基因,并對其新融合基因進(jìn)行初步功能研究,以深化我們對PAX5相關(guān)融合基因致白血病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)。3.分析BCR/ABL1陽性急性白血病中BTG1基因缺失的發(fā)生情況,闡述伴有B

2、TG1基因缺失的BCR/ABL1陽性急性白血病的臨床及實(shí)驗(yàn)室特征,初步探討B(tài)TG1缺失與BCR/ABL1陽性急性白血病的發(fā)病及復(fù)發(fā)的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.通過R顯帶技術(shù)對84例患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行核型分析,并選用位于9p13 PAX5基因兩端的RP11-344B23和RP11-652D9克隆,常規(guī)抽提DNA,采用缺口平移法標(biāo)記熒光素,應(yīng)用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,

3、FISH)對65例B-ALL及19例伴有abn(9p)異常的患者進(jìn)行PAX5基因重排或缺失篩選,并分析其臨床及實(shí)驗(yàn)室特征。
　　2.收集7例伴有dic(7;9)的患者骨髓標(biāo)本,其中4例應(yīng)用DNA抽提試劑盒(Invitrogen公司生產(chǎn))抽提基因組DNA,各自送檢至少1.5ug DNA于上海伯豪生物技術(shù)有限公司,選用安捷倫人類比較基因組芯片(Agligent Technologies,Santa Clara,CA,USA,244K)

4、對4例患者進(jìn)行Array-CGH技術(shù)檢測,同時(shí)應(yīng)用送檢公司所提供的軟件(Agilent Genomic Workbench Lite Edition6.5software)進(jìn)行數(shù)據(jù)與圖像的分析,明確7號(hào)和9號(hào)染色體的重排情況;利用RT-PCR驗(yàn)證易位中PAX5新對手基因(位于7p13的UBE2D4基因);設(shè)計(jì)引物并利用KOD高保真酶擴(kuò)增出PAX5-UBE2D4融合基因全長,根據(jù)后續(xù)功能研究的需要分別將PAX5-UBE2D4及BCR/AB

5、L兩個(gè)融合基因全長克隆到慢病毒載體LV5。采用慢病毒包裝體系包裝PAX5-UBE2D4及BCR/ABL病毒,并用病毒侵染NIH-3T3細(xì)胞及小鼠原B細(xì)胞BaF3細(xì)胞株,成功構(gòu)建過表達(dá)PAX5-UBE2D4、BCR/ABL、PAX5-UBE2D4+BCR/ABL三種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,通過Western Blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)情況,繪制生長曲線、甲基纖維素集落形成實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量PCR等情況觀察這些對NIH-3T3及BaF3細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化能力。

6、>　　3.收集2001-2013年期間在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院診斷和治療的BCR/ABL1陽性急性白血病44例,選用安捷倫人類比較基因組芯片對22例患者進(jìn)行Array-CGH技術(shù)檢測,并對這44例患者的骨髓標(biāo)本mRNA,利用RT-PCR精確定位BTG1基因缺失位點(diǎn),并總結(jié)BTG1缺失組患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室特征,分析其與發(fā)病機(jī)制及復(fù)發(fā)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.伴隨9p13/PAX5重排患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室特征
　　6

7、5例B-ALL及19例9p13異?；颊咧蠵AX5基因缺失的有20例(23.8％),PAX5基因易位的有2例(2.4％),PAX5基因擴(kuò)增1例(1.2％),總的異常率為27.4％(23/84)。伴有t(9;22)的PAX5基因重排陽性率高于不伴有t(9;22)的PAX5基因重排率,PAX5基因重排在不同性別、年齡及不同白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板水平,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)。
　　2.PAX5-UBE2D4融合基因的克隆

8、及功能研究
　　應(yīng)用FISH技術(shù)、比較基因組雜交芯片、RT-PCR和基因測序技術(shù)對其中1例患者白血病細(xì)胞dic(7;9)(p11-13;p13)的斷裂點(diǎn)進(jìn)行精確定位,克隆到一個(gè)新的累及PAX5和泛素結(jié)合酶UBE2D4的融合基因,PAX5-UBE2D4。該融合基因由PAX5的1-7號(hào)外顯子和UBE2D4的2-7號(hào)外顯子融合而成,且UBE2D4基因的開放閱讀框出現(xiàn)移碼后提前終止。
　　通過分子克隆及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),利用攜帶PAX5

9、-UBE2D4及BCR/ABL慢病毒載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞及 BaF3細(xì)胞,對其生物學(xué)特性進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn), PAX5-UBE2D4能促進(jìn)細(xì)胞的生長,且能在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基形成集落,同時(shí)PAX5-UBE2D4可使 BaF3細(xì)胞減少對IL-3的依賴。Western Blot結(jié)果顯示,PAX5-UBE2D4融合蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核,在細(xì)胞漿可少量表達(dá),融合蛋白大小約55KDa。通過定量PCR檢測PAX5的表達(dá),感染組細(xì)胞均表現(xiàn)

10、為PAX5高表達(dá)。
　　3.BTG1基因缺失在Ph陽性急性白血病中的發(fā)生率及作用
　　在44例初治的BCR/ABL1陽性急性白血病中,共有14例患者出現(xiàn)BTG1缺失(14/39,31.8％),包括10例BCR/ABL1陽性的急性B淋巴細(xì)胞白血病(10/32,31.3％),2例混合表型急性白血病(2/6,33.3％),2例慢性粒細(xì)胞白血病急變期(2/6,100％)。在此研究中,共精確定位5種BTG1缺失斷裂位點(diǎn),從第284個(gè)至

11、第304個(gè)堿基,橫跨20個(gè)堿基對,形成截短型BTG1轉(zhuǎn)錄本。在BTG1缺失型及野生型患者相比較,兩組在外周血 WBC計(jì)數(shù)、Hb水平、PLT計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比例、性別、年齡及化療的總體緩解率方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)通過對急性B淋巴細(xì)胞白血病中PAX5基因異常進(jìn)行FISH篩選,發(fā)現(xiàn)PAX5基因異常是急性 B淋巴細(xì)胞白血病中最常見的一類遺傳學(xué)異常,還可見于AML-M2,同時(shí)常伴隨常見的再現(xiàn)性遺傳學(xué)異

12、常,如t(9;22)(q34;q11),在B細(xì)胞的發(fā)育分化及增殖過程起協(xié)同作用,誘發(fā)B-ALL的發(fā)生發(fā)展。
　　2.發(fā)現(xiàn)一種累及PAX5基因的新獲得性染色體易位:dic(7;9)(p11-13;p13)。該易位基因組水平的斷裂點(diǎn)分別位于PAX5第7內(nèi)含子及UBE2D4第1內(nèi)含子之間。與野生型PAX5蛋白一樣,PAX5-UBE2D4的融合蛋白位于細(xì)胞核內(nèi),對PAX5的轉(zhuǎn)錄活性可能有一定影響,PAX5-UBE2D4融合蛋白能使BaF3