ghrelin對動脈硬化內(nèi)皮細胞作用的臨床和基礎研究.pdf

1、背景和目的:以動脈粥樣硬化(atheroselerosis，動脈粥樣硬化)為主要病理改變的心腦血管疾病嚴重威脅著人類健康。雖然眾多科學家傾注了大量的心血進行研究，但是，由于動脈粥樣硬化發(fā)病機制復雜，目前對其發(fā)病機制仍然存在許多未解難題。
　　Ghrelin是一種由28個氨基酸組成的多肽，最早在胃的組織中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究認為它是生長激素的內(nèi)源性配體，能夠刺激生長激素分泌和增加攝食并減少脂肪利用，最終形成正能量平衡。最近研究發(fā)現(xiàn)，gh

2、relin除上述作用外，由于其本身及其受體在心血管系統(tǒng)的廣泛分布，而被認為與心血管疾病存在某種聯(lián)系?；A研究大多認為ghrelin對心血管具有保護作用，但是臨床研究的結果卻缺乏一致性，有部分研究發(fā)現(xiàn)外周血ghrelin水平與動脈粥樣硬化程度指標——頸動脈內(nèi)膜中層厚度(CIMT)呈負相關，既ghrelin是動脈粥樣硬化的保護因素，而另外的研究卻提示ghrelin與CIMT呈正相關關系或無關;并且目前尚未見ghrelin與動脈硬度指標——脈

3、搏波速度(PWV)關系的臨床研究報告?；谏鲜銮闆r，本研究首先對老年代謝綜合征患者的資料進行分析，并引入PWV評價大動脈僵硬度，綜合評價血管情況，來闡述ghrelin水平與動脈硬化的關系。
　　關于ghrelin與動脈粥樣硬化的機制研究方面，由于氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)在動脈粥樣硬化中的作用非常重要，其可通過多種途徑促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，其中誘導血管內(nèi)皮

4、細胞凋亡為其初始作用之一;再有，內(nèi)皮細胞的損傷和凋亡被認為是動脈粥樣硬化形成的始動環(huán)節(jié)，并在其發(fā)展中起重要作用，與其他因素相互協(xié)同、相互影響，促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，所以，本研究的基礎研究部分，利用oxLDL誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)凋亡過程中加入ghrelin干預，并在此基礎上加用LY294002(PI3K阻滯劑)，PD98059（ERK1/2阻滯劑），以期分析其可能的細胞信號通路。
　　臨床研究部分:
　　

5、方法:本研究為橫斷面研究。2011年4月到2012年4月在我院就診的年齡＞60歲的老年患者5789人中篩選所有符合入選標準并同意參加本研究的代謝綜合征患者142例為代謝綜合征組(MS)。代謝綜合征符合2004年中華醫(yī)學會糖尿病分會提出的CDS診斷標準。另外篩選性別、年齡匹配的非代謝綜合征老年人66例為對照組。測量身高、體重、血壓等臨床參數(shù)，并抽血檢測ghrelin、血脂、血糖等生化指標，同時檢測臂踝脈搏波速度(baPWV)和CIMT。<

6、br>　　采用SPSS13.0版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以(x)±s表示，計數(shù)資料以數(shù)量（率）表示。計量資料組間比較用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料用x2檢驗。兩個變量之間的關系用相關系數(shù)表示，多個變量之間關系用多元回歸分分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:MS患者ghrelin水平較正常對照組低(t=1.992，P=0.048)，而CIMT(t=5.336，P=0.000)及baPWV(t=2.698，P=0.

7、007)則較高;頸動脈狹窄發(fā)生率MS人群明顯高于對照組(x2=5.696，P=0.017)。MS組中ghrelin與baPWV(r=0.412,P=0.001)、CIMT(r=0.213,P=0.035)、LDL(r=0.412,P=0.001)、總膽固醇(r=0.305，P=0.000)，年齡(r=-0.186，P=0.014)、BMI(r=-0.553，P=0.014)相關，多元回歸分析在調(diào)整了年齡、性別、血壓、血糖等因素后(R2=

8、0.318，P=0.023),ghrelin與baPWV(β=0.532,P=0.000,95％CI27.97～32.67)、LDL(β=-0.600,P=0.004,95％CI-216.66～-278.97)、BMI(β=-0.400, P=0.023,95％CI-29.82～-24.16)獨立相關，與CIMT無關。
　　結論:ghrelin水平在MS患者中較低。Ghrelin水平隨動脈僵硬度增加及動脈粥樣硬化斑塊的加重而升高。

9、老年MS患者中ghrelin隨年齡增加而降低，隨BMI增加而下降，隨LDL升高ghrelin水平升高。
　　基礎研究部分:
　　方法:
　　第一步確定oxLDL對HUVEC細胞的作用:將細胞分為對照組，5mg/LoxLDL，10mg/L oxLDL，20mg/L oxLDL組，分別作用6小時，12小時，24小時，48小時。分別用MTT法和流式細胞儀法檢測細胞凋亡情況。目的是獲得oxLDL導致HUVEC細胞損傷的濃度及時

10、間關系。
　　第二步:在第一步的實驗基礎上將細胞分為對照組，10mg/L oxLDL干預組，10-6mol/L ghrelin干預組，10-8mol/Lghrelin組+10mg/L oxLDL，10-7mol/Lghrelin+10mg/L oxLDL組，10-6mol/L ghrelin+10mg/L oxLDL組，分別用ghrelin預處理10分鐘，30分鐘，60分鐘，120分鐘后再用oxLDL處理120分鐘，對照組用生理鹽

11、水干預，10mg/L oxLDL干預組在預處理階段用生理鹽水進行處理，10-6mol/L ghrelin干預組在干預階段用生理鹽水處理。完成上述處理后，分別用MTT法和流式細胞儀法檢測細胞凋亡情況。目的是獲得ghrelin對HUVEC細胞作用的濃度及時間關系。
　　第三步:在以上實驗結果的基礎上（恰當?shù)臐舛群妥饔脮r間）將細胞分為對照組，oxLDL組，ghrelin組，ghrelin+oxLDL組，ghrelin+D-Lys-3-G

12、HRP-6(ghrelin受體GHS-R1a阻滯劑，10-4mol/L在加用ghrelin前預處理1小時)組，ghrelin+oxLDL+LY294002（PI3K阻滯劑，10-5mol/L預處理1小時）組，ghrelin+oxLDL+PD98059(ERK1/2阻滯劑，5×10-5mol/L預處理30分鐘)組。凋亡相關蛋白的表達及p-Akt、p-ERK1/2情況來進一步研究ghrelin抗HUVEC細胞凋亡的機制。
　　第四步:

13、在第三步的基礎上加用ghrelin受體抑制劑D-Lys-3-GHRP-6、PI3K抑制劑LY294002和ERK1/2抑制劑PD98059。ghrelin受體GHS-R1a阻滯劑，10-4mol/L在加用ghrelin前預處理1小時，LY294002（PI3K阻滯劑）10-5mol/L預處理1小時，PD98059（ERK1/2阻滯劑）5×10-5mol/L預處理30分鐘，然后分別加入ghrelin及oxLDL。觀察細胞凋亡情況（MTT和

14、流式細胞儀法）。
　　結果:HUVEC細胞在不同濃度(5mg/L、10mg/L、20mg/L)和不同作用時間(10分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘)的oxLDL干預后，細胞存活率均較對照組有不同程度下降，差異具有統(tǒng)計學意義。當oxLDL濃度達到20mg/L時，其影響HUVEC細胞生存的作用達到本研究觀察到的最大效應(P＜0.05)。HUVEC細胞的數(shù)量在oxLDL刺激10min后開始明顯減少(P＜0.05)，于120min達到

15、本研究觀察的最高峰(P＜0.05)。
　　觀察ghrelin對HUVEC細胞活性的影響結果顯示，HUVEC細胞經(jīng)不同濃度(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)ghrelin預處理10min-120min后，再加10mg/L的oxLDL培養(yǎng)120分鐘，結果顯示隨ghrelin濃度增加和作用時間延長，HUVEC細胞存活數(shù)量也相應增加，在濃度達到10-6mol/L、作用時間達到30min時，較單純oxLDL處理組

16、差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，濃度為10-6mol/L作用時間為120分鐘時最為顯著(P＜0.05)，HUVEC數(shù)量與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。提示，ghrelin對HUVECs具有明顯保護作用，能顯著抑制oxLDL對HUVECs的損傷。單純ghrelin處理組存活率較對照組沒有明顯差別，提示ghrelin在正常情況下對內(nèi)皮細胞生長沒有明顯影響。
　　不同濃度不同作用時間ghrelin處理組相比，發(fā)現(xiàn)ghrelin

17、的內(nèi)皮細胞保護作用呈時間和濃度依賴性。
　　為進一步明確ghrelin對oxLDL導致的HUVECs細胞凋亡的保護作用機制，我們用Western Blot法檢測各組細胞凋亡相關蛋白的表達情況，包括Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Cleaved caspase-3表達，計算Bax/Bcl-2比值。
　　Bcl-2蛋白:與對照組HUVEC細胞相比，oxLDL(10mg/L)可使Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P＜0.05);單純ghr

18、elin處理組則沒有明顯影響;加入ghrelin后，即10-6mol/L ghrelin和10mg/L oxLDL共處理組使Bcl-2的表達較單純oxLDL組顯著上升(P＜0.05)。
　　Bax蛋白:與對照組HUVEC細胞相比，oxLDL可使Bax蛋白表達量顯著升高(P＜0.05);加入ghrelin后，即ghrelin和oxLDL共處理組使Bax的表達較mmol/L單純oxLDL組明顯下降(P＜0.05);與對照組比較，單純g

19、hrelin組Bax蛋白表達量無明顯變化(P＞0.05)。
　　Bax/Bcl-2比值:與對照組HUVEC細胞相比，oxLDL可使Bax/Bcl-2比值顯著升高(P＜0.05);加入ghrelin后，即和oxLDL共處理使Bax/Bcl-2比值較單純oxLDL組明顯下降(P＜0.05);與單純oxLDL處理組相比，單純ghrelin處理組Bax/Bcl-2比值無明顯變化(P＞0.05)。
　　Cleaved caspase-

20、3蛋白:與對照組HUVEC細胞相比，oxLDL可使Cleavedeaspase-3蛋白表達量顯著升高(P＜0.05);加入ghrelin后，即ghrelin和oxLDL共處理使Cleaved caspase-3蛋白表達量較單純oxLDL組明顯下降(P＜0.05);與單純oxLDL處理組相比，單純ghrelin處理組Cleaved caspase-3蛋白表達量無明顯變化(P＞0.05)。
　　上述結果提示，oxLDL可以促進細胞凋亡

21、蛋白Bax和Cleaved caspase-3的表達，減少抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2的表達;而ghrelin可以抑制oxLDL引起的Bax和Cleaved caspase-3表達增加，促進Bcl-2表達，這可能是ghrelin對oxLDL引起的細胞損傷具有保護作用的重要機制。
　　我們的研究表明，ghrelin可以激活Akt使之磷酸化為p-Akt，也可以激活ERK1/2磷酸化。所以推論ghrelin的生物學效應可能是通過Akt和E

22、RK1/2激活磷酸化而產(chǎn)生。本研究顯示經(jīng)ERK1/2抑制劑(PD98059)預處理，可以抑制ghrelin引起的ERK1/2磷酸化，但不影響Akt激活;然而PI3K/Akt通路抑制劑(LY294002)可以同時減弱ghrelin引起的Akt和ERK1/2磷酸化。上述結果表明，ghrelin抗oxLDL導致的HUVEC細胞凋亡作用可能與激活PI3K/Akt和MAPK通路有關。Gherlin影響HUVEC細胞ERK1/2的作用達峰時間為30

23、分鐘，作用Akt的達峰時間為60分鐘。
　　本研究顯示分別經(jīng)10-4mol/L的ghrelin受體阻滯劑D-Lys-3-GHRP-6預處理1小時、5×10-5mol/L的ERK1/2抑制劑PD98059預處理30分鐘、10-5mol/L的PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預處理1小時后發(fā)現(xiàn)，上述各組細胞經(jīng)MTT法和流式細胞儀法檢測存活情況與對照組比較沒有顯著差別P＞0.05，與oxLDL組比較存活率顯著增高具有統(tǒng)計學差別P

24、＜0.05。提示:上述三種抑制劑對細胞存活沒有明顯影響。D-Lys-3-GHRP-6預處理后加用oxLDL和ghrelin處理的細胞其存活率較單純D-Lys-3-GHRP-6預處理組和對照組有所下降，但高于oxLDL組，提示:ghrelin受體可能參與了ghrelin抑制細胞凋亡的過程，同時也可能存在GHR外的細胞通路。PD98059預處理后加用oxLDL和ghrelin處理的細胞其存活率較單純PD98059預處理組和對照組有所下降，但

25、高于oxLDL組，提示:ERK1/2通路可能參與了ghrelin抑制細胞凋亡的過程，同時也可能存在GHR外的細胞通路。LY294002預處理后加用oxLDL和ghrelin處理的細胞其存活率較單純LY294002預處理組和對照組有所下降，高于oxLDL組，但MTT法結果沒有統(tǒng)計學差別P=0.2088，提示:Akt通路可能參與了ghrelin抑制細胞凋亡的過程，由于該通路阻斷后較其他兩組阻滯劑效果更為明顯，因此推斷該通路可能是ghreli

26、n抑制細胞凋亡的主要作用通路。
　　結論:老年MS患者血清ghrelin濃度較低;在老年MS患者中，ghrelin濃度隨動脈僵硬度增加及動脈粥樣硬化斑塊的加重而升高，其中與動脈僵硬度的關系不受傳統(tǒng)危險因素的影響，與ghrelin獨立相關;老年MS患者血清ghrelin水平隨年齡、BMI增加而下降，隨LDL水平升高而升高。本研究在體外實驗中發(fā)現(xiàn)oxLDL能夠造成內(nèi)皮細胞損傷和凋亡;ghrelin干預可以減輕oxLDL對內(nèi)皮細胞凋亡的