大、小鼠卵泡培養(yǎng)方法及其在雌性生殖毒性研究中的應(yīng)用.pdf

1、生殖和發(fā)育功能障礙是當(dāng)前嚴(yán)重影響人體健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。外源性化學(xué)物作用于雌性生殖系統(tǒng)可以導(dǎo)致卵巢周期紊亂或不育,致使人群中自發(fā)性流產(chǎn)率、子代發(fā)育異常、生育力下降等顯著增加。同時(shí),雌性所有的配子在出生前就已經(jīng)形成,出生時(shí)卵泡的數(shù)量是固定的,如果破壞了,無額外的配子補(bǔ)償,后果較雄性更嚴(yán)重。因此,篩選和鑒定具有雌性生殖毒性的化學(xué)物,闡明其毒作用機(jī)制,對(duì)防治化學(xué)物引起的生殖系統(tǒng)危害具有重要意義。 近年來由于組合化學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助

2、藥物設(shè)計(jì)等的快速發(fā)展帶來新化學(xué)物的快速增長(zhǎng),現(xiàn)有毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足化學(xué)物快速增長(zhǎng)的需求。因此,國際上的發(fā)展趨勢(shì)是在方法學(xué)上要求發(fā)展符合“4R"原則(替代、減少、優(yōu)化和可靠性)、具有高通量、所需受試樣品量少的試驗(yàn)方法。目前雌性生殖毒性評(píng)價(jià)方法主要采用體內(nèi)試驗(yàn),存在的主要問題是整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不敏感、周期長(zhǎng)、所需受試樣品量多。體內(nèi)試驗(yàn)難以揭示毒作用位點(diǎn)和毒作用機(jī)制。為此,近幾年國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種體外雌性生殖毒性試驗(yàn)方法,包括卵巢器官

3、和卵巢皮質(zhì)薄片培養(yǎng)方法和大鼠顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞體外毒性試驗(yàn)方法。但這些體外方法無法對(duì)卵泡發(fā)育和卵子生成做出客觀評(píng)價(jià),而這應(yīng)是雌性生殖毒性研究的關(guān)鍵所在。因此,迫切需要發(fā)展既能快速檢測(cè)雌性生殖毒性又能更好地研究其作用機(jī)制的新方法。 卵泡體外培養(yǎng)方法是近年來發(fā)展的將早期卵泡不成熟卵母細(xì)胞(GV期或GV前期)在體外發(fā)育到可正常受精的成熟卵母細(xì)胞(MII)的方法。由于該方法能對(duì)卵巢的主要功能即卵泡發(fā)育、激素生成和卵子發(fā)生進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,可

4、在卵泡不同發(fā)育階段對(duì)卵泡每一組分進(jìn)行分析,因此受到生殖生物學(xué)和生殖毒理學(xué)界的關(guān)注。目前國外已經(jīng)成功建立或基本建立綿羊、豬、小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)模型,并已應(yīng)用于生殖生物學(xué)和生理學(xué)對(duì)卵泡發(fā)育和調(diào)控的研究。已有學(xué)者嘗試將小鼠模型用于生殖毒性研究,但尚未發(fā)展成為毒性試驗(yàn)系統(tǒng)。有關(guān)大鼠腔前卵泡體外研究極少,僅見大鼠卵泡體外短期階段性培養(yǎng)的個(gè)別研究,目前國內(nèi)外尚未見類似小鼠可比較完整地觀察大鼠卵泡發(fā)育過程和卵子形成的體外培養(yǎng)系統(tǒng)的報(bào)道。 本

5、研究擬借鑒國外的經(jīng)驗(yàn),首先建立小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法,在此基礎(chǔ)上嘗試建立大鼠腔前卵泡的體外培養(yǎng)方法；然后選擇已知卵巢毒物探討大小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法用于雌性生殖毒物鑒定和機(jī)制研究的可行性,目的是為建立一個(gè)既可對(duì)雌性生殖毒物進(jìn)行篩選或鑒定,又可對(duì)生殖毒作用機(jī)制進(jìn)行研究的體外毒性試驗(yàn)系統(tǒng)提供依據(jù)。 一、小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法的建立 采用機(jī)械性方法分離出生后(post-natal day,PND)PND12～14(C57

6、81/6JxCBA/Ca)小鼠卵巢內(nèi)直徑為100～130pun的腔前卵泡,96孔板單個(gè)卵泡在石蠟油覆蓋的M1培養(yǎng)基內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)12d后誘導(dǎo)排卵16h,觀察卵泡發(fā)育、激素分泌和卵子形成,并將體外卵母細(xì)胞的成熟情況與體內(nèi)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況(in vivo growth and in vitromaturation of oocytes,IVM)進(jìn)行比較,以判斷體外培養(yǎng)方法是否成功。 1.小鼠卵泡體外發(fā)育特征 7只小鼠分離出41

7、9個(gè)卵泡,機(jī)械性分離完整卵泡率為376/419(89.74％),卵泡和卵母細(xì)胞直徑分別從118.51±10.40μm和50.75±1.67μm增加到培養(yǎng)d12的452.03±110.25μm和69.54±1.55μm;培養(yǎng)d12卵泡存活率為86.87％(364/419),有腔形成率為31.03％(130/419);誘導(dǎo)排卵后COCs排出率為50.60％(212/419)。 小鼠卵泡體外發(fā)育形態(tài)學(xué)變化：體外培養(yǎng)的部分卵泡經(jīng)歷從腔前

8、卵泡、有腔卵泡、排卵前卵泡、卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)排出、卵母細(xì)胞成熟和極體排出的形態(tài)學(xué)變化,也有部分卵泡不發(fā)生腔樣結(jié)構(gòu)改變,在卵泡中央可見卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體,周圍顆粒細(xì)胞平鋪在培養(yǎng)板上,間隙不明顯。 2.小鼠卵泡體外激素分泌的變化 收集d10、d12、d13更換的培養(yǎng)基測(cè)定卵泡激素P,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集1-3個(gè)樣品；收集d4、6、8、10、12更換的培養(yǎng)基測(cè)定卵泡激素E2。E2和P的檢測(cè)采用磁性酶聯(lián)免疫法,E

9、2抗體用17 β-oestradiol,質(zhì)控管在600～900p/ml;P質(zhì)控管在7～13ng/ml。體外培養(yǎng)卵泡從d4天開始檢測(cè)到E2增加,并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)增加,d10～12維持在較高水平；d12誘導(dǎo)排卵刺激后P分泌量急劇增加,體外培養(yǎng)卵泡分泌E2和P激素與體內(nèi)分泌特征一致。 3.小鼠卵母細(xì)胞體外成熟 研究結(jié)果顯示,IVG組4.61％(10/217)卵母細(xì)胞不能恢復(fù)成熟(停止在Gv期),76.50％(166/2

10、17)停止減數(shù)分裂在GVBD期,18.89％(41/217)卵泡發(fā)出PB;而IVM組1.24％(3/241)的卵母細(xì)胞不能恢復(fù)成熟(停止在GV期),45.23％(109/241)停止減數(shù)分裂在GVBD,53.53％(41/241)卵泡發(fā)出PB;能完全成熟過渡到MII期(PB排出)卵母細(xì)胞的比例在各個(gè)試驗(yàn)組之間有差異；沒有一個(gè)卵母細(xì)胞完全發(fā)育成染色體不分離的超倍體。 綜上可見,從卵泡發(fā)育、激素合成和卵母細(xì)胞成熟三方面顯示本研究建立

11、的小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法基本是成功的,與國內(nèi)上海計(jì)生所汪玉寶等報(bào)道實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本-致,但本研究卵母細(xì)胞PB形成率低于國外Sun F等微滴三維培養(yǎng)結(jié)果,有待進(jìn)一步優(yōu)化和完善培養(yǎng)體系。 二、大鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法的建立 1.大鼠卵泡體外培養(yǎng)條件的確定, 2.大鼠卵泡體外發(fā)育特征4只PND13 SD大鼠共分離出296個(gè)腔前卵泡。機(jī)械性分離完整卵泡率為96.28％(285/296),卵泡和卵母細(xì)胞直徑分別從141.26

12、±8.82μm和51.25±1.37μm增加到培養(yǎng)day11 543.21±131.11μm和70.48±2.89μm,培養(yǎng)d11卵泡存活率為92.23％(273/296),d6有腔形成率為67.91％(201/296),d11有腔形成率為75.67％(224/296),COCs排出率為44.93％(133/296)。 3.大鼠卵泡體外激素分泌情況收集D4、6、8、10、12更換的培養(yǎng)基測(cè)定。 三、大鼠卵泡體外方法作為毒

13、性檢測(cè)系統(tǒng)的初步驗(yàn)證 由于本研究建立的小鼠卵泡體外培養(yǎng)方法在卵母細(xì)胞PB形成率上尚達(dá)不到國外水平,有待改進(jìn)。另一方面,本研究建立的大鼠體外卵泡培養(yǎng)方法多項(xiàng)指標(biāo)明顯較小鼠卵泡培養(yǎng)效果好,加上大鼠是生殖毒性實(shí)驗(yàn)中最常使用的動(dòng)物。因此,本研究在目前的條件下首先選擇大鼠卵泡體外培養(yǎng)方法用于化學(xué)物雌性生殖毒性及其機(jī)制的研究。 本研究選擇氯化鎘、DEHP、MEHP和噻氨酯噠唑Nocodazole四種卵巢毒物,根據(jù)受試物作用特征,觀察

14、其對(duì)大鼠卵泡的體外毒性。 1.氯化鎘 鎘是一種常見的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明鎘可干擾卵巢內(nèi)分泌功能,使大鼠動(dòng)情周期延長(zhǎng),卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；可以抑制卵泡的正常生長(zhǎng)發(fā)育,抑制雌性動(dòng)物排卵,造成暫時(shí)性不育；可以通過促使體內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡而誘導(dǎo)卵泡閉鎖,進(jìn)而對(duì)卵母細(xì)胞的成熟、排卵等造成影響。體外實(shí)驗(yàn)表明氯化鎘可以抑制大鼠顆粒細(xì)胞孕酮的合成。本研究從氯化鎘對(duì)卵泡發(fā)育、激素合成和不同發(fā)育階段卵泡的影響三個(gè)方面研究氯化

15、鎘的卵巢毒性及其可能的作用機(jī)制。 2.鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)和鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHF) DEHP和MEHP屬于鄰苯二甲酸酯類。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DEHP的雌性生殖毒性作用主要是通過其代謝產(chǎn)物MEHP影響卵巢功能,作用位點(diǎn)主要是卵巢顆粒細(xì)胞。 3.噻氨酯噠唑(Nocodazole) 噻氨酯噠唑是一種干擾微管組裝合成的抗腫瘤藥物。和秋水仙素在β-tubulin上Arg-390競(jìng)

16、爭(zhēng)結(jié)合同一結(jié)合位點(diǎn),直接影響微管聚合作用和微管依賴性進(jìn)程?？梢詫?dǎo)致細(xì)胞周期永久性或短暫阻滯,以往研究證實(shí)噻氨酯噠唑可以明顯地增加抑制在第一次減數(shù)分裂的卵泡數(shù)。,初步驗(yàn)證了大鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法用于雌性生殖毒物鑒定和機(jī)制研究的可行性。 小結(jié)： 1、基本建立了小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法。 2、建立了大鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)方法,國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未報(bào)道比較完整地觀察大鼠卵泡發(fā)育過程和卵子形成的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。 3、用大鼠

17、腔前卵泡培養(yǎng)方法觀察了四種化學(xué)物對(duì)卵泡發(fā)育、激素合成和卵子形成的影響,以及對(duì)不同發(fā)育階段卵泡的毒作用。進(jìn)一步揭示了氯化鎘、DEHP、MEHP、噻氨酯噠唑四種卵巢毒物的雌性生殖毒作用特征,為闡明其毒作用機(jī)制提供了某些依據(jù)。 4、初步提出一個(gè)以卵泡形態(tài)學(xué)改變、卵泡分化階段、卵泡存活率、卵丘細(xì)胞粘液化、激素(E2、P)分泌量、卵母細(xì)胞直徑、極體形成率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的大鼠腔前卵泡體外毒性研究系統(tǒng)。該系統(tǒng)可有效鑒定卵巢毒物,并可用于毒物作用階