S100A13基因?qū)谞钕侔㏕T細(xì)胞生長特性及FGF-1釋放的研究.pdf

1、目的:
　　建立穩(wěn)定過表達(dá)S100A13基因的甲狀腺癌TT細(xì)胞系,研究S100A13基因過表達(dá)對甲狀腺癌TT細(xì)胞生長及細(xì)胞周期的影響,探討S100A13基因在甲狀腺癌發(fā)生中的作用;將S100A13 shRNA入門質(zhì)粒轉(zhuǎn)染甲狀腺癌TT細(xì)胞系,研究S100A13沉默對應(yīng)激誘導(dǎo)FGF-1釋放的影響。
　　方法:
　　應(yīng)用Lipofectamine2000將真核表達(dá)載體pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13和空載體pc

2、DNA3.1/NT-GFP導(dǎo)入TT細(xì)胞系,經(jīng)G418抗性篩選得到穩(wěn)定的克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)成系,激光共聚焦顯微鏡觀察外源性S100A13蛋白定位。采用Real Time PCR和Western Blot鑒定穩(wěn)定表達(dá)S100A13的TT細(xì)胞系,應(yīng)用細(xì)胞生長曲線、流式細(xì)胞術(shù)研究過表達(dá) S100A13基因?qū)?TT細(xì)胞生長速率和細(xì)胞周期的影響。將S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TT細(xì)胞,應(yīng)用Real Time PCR法、間

3、接免疫熒光法及 Western Blot方法檢測細(xì)胞內(nèi) S100A13基因及蛋白表達(dá)的抑制效率,進(jìn)一步應(yīng)用間接免疫熒光,RT-PCR及ELISA檢測S100A13沉默后無血清處理甲狀腺癌TT細(xì)胞內(nèi)FGF-1釋放變化。
　　結(jié)果:
　　成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)S100A13和空載體的細(xì)胞系TT-S100A13-GFP、TT-GFP。TT-S100A13-GFP細(xì)胞組較 TT-GFP和TT細(xì)胞組生長速度快[(2.30±0.24)×1

4、05vs.(1.40±0.25)×105和(1.50±0.22)×105,(P<0.05)];流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示TT-S100A13-GFP細(xì)胞組S期和G2/M期所占比例較TT-GFP和TT細(xì)胞組明顯增高。[S期:(6.47±0.14)％vs.(5.86±0.23)%和(5.99±0.28)%,(P<0.05),G2/M:(50.27±0.66)%vs.(39.39±0.23)%和(39.64±0.64)%,(P<0.05)]。S100

5、A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體轉(zhuǎn)染TT細(xì)胞后能夠抑制S100A13基因及蛋白表達(dá)。應(yīng)用間接免疫熒光、Real Time PCR及 Western-blot方法檢測 S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體對S100A13靶基因的抑制效率約為50%, SR-PSOX shRNA干擾對S100A13基因無抑制作用。間接免疫熒光表明,S100A13 shRNA誘導(dǎo)S100A13沉默對正常培養(yǎng)的甲狀腺癌TT細(xì)胞

6、系的FGF-1的分布沒有影響,FGF-1彌散分布于整個細(xì)胞;無血清處理后胞質(zhì)中的FGF-1明顯減少,但S100A13沉默的TT細(xì)胞胞質(zhì)中FGF-1較TT細(xì)胞多。RT-PCR結(jié)果顯示,S100A13沉默對正常培養(yǎng)的甲狀腺癌 TT細(xì)胞系的FGF-1的mRNA表達(dá)水平無影響,但無血清處理后S100A13沉默的TT細(xì)胞中FGF-1的表達(dá)較高。ELISA結(jié)果顯示,S100A13 shRNA誘導(dǎo)S100A13沉默對正常培養(yǎng)上清中FGF-1的濃度無影

7、響(P>0.05);無血清處理后S100A13沉默的TT細(xì)胞培養(yǎng)上清中FGF-1的濃度較低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)S100A13基因的甲狀腺癌TT細(xì)胞系,穩(wěn)定過表達(dá)S100A13基因?qū)T細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用,外源性S100A13基因亞細(xì)胞定位于 TT細(xì)胞胞質(zhì)。內(nèi)源性 S100A13基因定位于 TT細(xì)胞胞質(zhì)。S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體能有效、特異性地抑制S100A