S100A13基因在甲狀腺癌中的表達及相關作用研究.pdf

1、甲狀腺癌(thyroid carcinoma)是內分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病機制尚未明確。S100蛋白家族是一個已發(fā)現(xiàn)有21個成員的鈣結合蛋白家族,S100蛋白通過對鈣離子的調節(jié)及與靶蛋白的相互作用在體內發(fā)揮多種生物學功能。S100A13屬于鈣結合蛋白家族的一個新成員,S100A13既具有S100蛋白家族的一些共性,又有其獨有的結構和功能特點。FGF-1是成纖維細胞生長因子家族重要的成員之一,一些高侵襲性的腫瘤與FGF-1的高表

2、達有關。研究表明S100A13通過介導FGF-1、IL-1α跨膜轉運,在腫瘤、炎癥、動脈硬化等疾病的病理過程中發(fā)揮著重要作用。
　　本研究在前期運用抑制性消減雜交技術( suppression subtractive hybridization, SSH)篩選正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織內差異表達的基礎上,通過免疫組織化學的方法檢測正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織內S100A13蛋白、FGF-1蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)并驗證了S100A13基

3、因在甲狀腺癌中的表達高于正常甲狀腺組織。在此基礎上,通過構建 S100A13基因真核表達載體、基因轉染等方法觀察S100A13基因在甲狀腺癌組織高表達后S100A13基因對人甲狀腺髓樣癌細胞(TT細胞)生長特性、裸鼠移植瘤生長的影響,結果發(fā)現(xiàn)高表達S100A13基因對TT細胞的生長具有促進作用,能促進TT細胞從G0/G1期向S期及G2/M期過渡,S100A13高表達的TT細胞裸鼠移植瘤生長速度最快,重量最重,移植瘤中S100A13的高表

4、達能增強Cyclin E、FGF-1、CD31蛋白的表達。隨后觀察shRNA干擾S100A13基因表達和使用Ca2+螯合劑后對TT細胞釋放FGF-1的影響,結果發(fā)現(xiàn)S100A13基因的沉默可以抑制FGF-1從細胞內釋放到細胞外,Ca2+螯合劑能有效拮抗無血清處理引起的TT細胞[Ca2+]i升高和S100A13、FGF-1蛋白的釋放。實驗結果表明S100A13基因高表達后促進FGF-1表達和釋放是甲狀腺癌發(fā)生和轉移的重要機制。
　　

5、第一部分，甲狀腺癌組織中S100A13和FGF-1蛋白的表達及意義
　　目的:探討S100A13、FGF-1蛋白在甲狀腺癌中的表達及臨床意義。方法:采用免疫組織化學法,檢測56例甲狀腺癌、15例甲狀腺腺瘤、14例甲狀腺正常組織中S100A13及FGF-1蛋白的表達。結果:甲狀腺癌、甲狀腺腺瘤、甲狀腺正常組織中S100A13蛋白陽性表達率分別為91.1％、66.7%、64.3%,FGF-1蛋白陽性表達率分別為89.3%、60.0%、

6、57.1%,其中甲狀腺癌與甲狀腺腺瘤、甲狀腺正常組織比較均有顯著性差異(P<0.05);伴有淋巴結轉移的甲狀腺癌組織S100A13、FGF-1蛋白強陽性表達明顯高于無淋巴結轉移者(P<0.05)。結論:S100A13蛋白、FGF-1蛋白在甲狀腺癌中陽性表達顯著高于甲狀腺腺瘤及正常甲狀腺組織,其強陽性表達與淋巴結轉移有關。
　　第二部分，S100A13對甲狀腺癌TT細胞生長特性的影響
　　目的:觀察S100A13基因高表達對T

7、T細胞生長特性的影響。方法:構建以綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)為報告基因的重組表達質粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,脂質體介導穩(wěn)定轉染 TT細胞,激光共聚焦顯微鏡觀察外源性S100A13蛋白在細胞中的定位,采用real-time RT-PCR和Western blot鑒定穩(wěn)定高表達 S100A13基因的TT細胞系,細胞生長曲線、流式細胞術方法檢測高表達 S100A13基因

8、對甲狀腺癌 TT細胞生長速率和細胞周期的影響。結果:酶切和測序結果證實重組質粒含有S100A13編碼區(qū)序列且插入方向正確,成功建立了穩(wěn)定高表達S100A13基因和空載體的TT細胞系TT-S100A13-GFP、TT-GFP。TT-S100A13-GFP、TT-GFP和TT細胞培養(yǎng)7天后細胞數(shù)目分別為(2.30±0.24)×105、(1.40±0.25)×105和(1.50±0.22)×105(P<0.05);TT-S100A13-GFP

9、、TT-GFP和TT經流式細胞儀檢測S期的細胞比例分別為6.47±0.14%、5.86±0.23%和5.99±0.28%(P<0.05), G2/M期的細胞比例分別為50.27±0.66%、39.39±0.23%和39.64±0.64%(P<0.05)。
　　結論:成功建立了穩(wěn)定高表達S100A13基因的TT細胞系,高表達S100A13基因對TT細胞的生長具有促進作用,促進TT細胞從G0/G1期向S期及G2/M期過渡。
　　

10、第三部分，S100A13對TT細胞裸鼠移植瘤生長影響的實驗研究
　　目的:通過建立裸鼠移植瘤模型,探討S100A13對TT細胞裸鼠移植瘤生長的作用,初步闡明S100A13在甲狀腺癌發(fā)生中的作用。方法:同時分別擴大培養(yǎng)穩(wěn)定高表達S100A13的TT細胞(TT-S100A13-GFP)和空載體(TT-GFP)TT細胞及TT細胞,將三種瘤細胞接種于裸鼠背部皮下,通過測量三組裸鼠移植瘤體積、瘤重,評價S100A13基因轉染對TT細胞裸鼠移

11、植瘤生長的影響;采用免疫組織化學方法檢測TT細胞裸鼠移植瘤中周期素E(Cyclin E)、FGF-1、血小板/內皮細胞黏附分子(CD31)蛋白的表達。結果:成功建立了TT-S100A13-GFP、TT-GFP及TT細胞裸鼠移植瘤模型。與TT-GFP及TT細胞組比較, TT-S100A13-GFP組裸鼠移植瘤生長速度明顯增快、體積明顯增大(第45天起有統(tǒng)計學差異,P<0.05)。TT-S100A13-GFP組裸鼠移植瘤瘤重大于TT-GFP

12、及TT組(P<0.05)。TT-S100A13-GFP組裸鼠移植瘤中Cyclin E、FGF-1、CD31蛋白表達明顯強于TT-GFP及TT組(P<0.05)。結論:S100A13的高表達能促進TT細胞裸鼠移植瘤生長;移植瘤中S100A13的高表達能增強Cyclin E、FGF-1、CD31蛋白的表達。
　　第四部分，shRNA干擾S100A13基因對TT細胞釋放FGF-1的影響
　　目的:探討S100A13沉默對無血清處理

13、TT細胞FGF-1釋放的影響。方法:將S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門質粒轉染TT細胞,應用Real TimePCR、間接免疫熒光法及Western blot方法檢測細胞內S100A13基因及蛋白表達的抑制效率,應用間接免疫熒光及ELISA檢測無血清處理TT細胞S100A13沉默后FGF-1釋放變化。結果:S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體轉染TT細胞后能夠抑制S100A13基因及蛋白表達,抑制

14、效率約為80%。間接免疫熒光法顯示FGF-1主要位于細胞漿和細胞核,無血清培養(yǎng)6h胞漿內FGF-1基本消失。ELISA結果顯示,S100A13沉默能降低無血清處理 TT細胞培養(yǎng)上清中 FGF-1的濃度(P<0.05)。結論: S100A13-shRNA pENTRTM/U6入門載體能有效、特異性地抑制S100A13基因及蛋白表達;S100A13基因的沉默可以抑制FGF-1從細胞內釋放到細胞外。
　　第五部分，Ca2+螯合劑對無血清

15、處理TT細胞內S100A13和FGF-1釋放的影響
　　目的:探討Ca2+螯合劑對無血清處理TT細胞內S100A13、FGF-1蛋白釋放的影響,初步闡明Ca2+在S100A13、FGF-1蛋白釋放過程中的作用。方法:應用激光共聚焦顯微鏡實時動態(tài)檢測細胞內、外Ca2+螯合劑BAPTA-AM(2.5μmol/L)、EGTA(2.5mmol/L)對無血清處理TT細胞1h[Ca2+]i的變化,采用Western Blot檢測無血清處理0h

16、、1h、2h、4h、6h細胞S100A13、FGF-1蛋白表達量,間接免疫熒光觀察BAPTA-AM、EGTA對無血清處理6h細胞S100A13、FGF-1蛋白熒光分布的影響,Western Blot檢測S100A13、FGF-1蛋白表達量, ELISA檢測培養(yǎng)上清FGF-1蛋白濃度。結果:激光共聚焦Ca2+熒光顯像結果顯示:正常培養(yǎng)的TT細胞[Ca2+]i約0.1~0.3μmol/L,在掃描期間較穩(wěn)定;無血清處理TT細胞[Ca2+]i在

17、23分鐘內相對穩(wěn)定,第23分鐘后TT細胞[Ca2+]i迅速上升出現(xiàn)Ca2+波峰,達1.6μmol/L,第40分鐘TT細胞[Ca2+]i下降,40分鐘至60分鐘[Ca2+]i約為0.3μmol/L—0.6μmol/L,1h內TT細胞平均[Ca2+]i明顯高于正常培養(yǎng)組(P<0.05)。EGTA、BAPTA-AM能明顯抑制無血清處理引起的TT細胞[Ca2+]i升高,平均[Ca2+]i與正常培養(yǎng)組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Wester

18、n Blot結果顯示無血清處理TT細胞S100A13、FGF-1蛋白表達量4h組、6h組均降低,0h、1h、2h三組間比較無統(tǒng)計學差異,4h組TT細胞S100A13、FGF-1蛋白表達與0h、1h、2h組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),6h組TT細胞S100A13、FGF-1蛋白表達與0h、1h、2h、4h組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。間接免疫熒光結果顯示無血清處理6h TT細胞內S100A13、FGF-1蛋白熒光強度較正常培養(yǎng)

19、組明顯減弱;EGTA、BAPTA-AM能拮抗無血清處理TT細胞內S100A13、FGF-1蛋白熒光變弱。Western Blot結果顯示無血清處理6h TT細胞S100A13、FGF-1蛋白表達量較正常培養(yǎng)組明顯降低,加入Ca2+螯合劑EGTA、BAPTA-AM時TT細胞S100A13、FGF-1蛋白表達量與正常培養(yǎng)組無明顯差異;上述各組細胞培養(yǎng)上清ELISA結果顯示,無血清處理6h組TT細胞培養(yǎng)上清中FGF-1濃度較其它4組明顯升高(