高尿酸血癥動物模型的建立及抗痛風(fēng)中藥的篩選.pdf

1、痛風(fēng)是長期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起組織損傷的一組異質(zhì)性疾病.臨床特點是：高尿酸血癥(hyperuricemia)、痛風(fēng)性急性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作、痛風(fēng)石沉積、特征性慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)畸形，常累及腎臟引起慢性間質(zhì)性腎炎和腎尿酸結(jié)石形成。痛風(fēng)的生化標(biāo)志是高尿酸血癥，指細(xì)胞外液的尿酸鹽呈超飽和狀態(tài)，一般認(rèn)為血尿酸≥416μmol/L時為高尿酸血癥。約5％-12％高尿酸血癥患者會發(fā)展成為痛風(fēng)。痛風(fēng)的急性發(fā)作是尿酸鈉在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織以結(jié)晶形式沉積

2、引起的急性炎癥反應(yīng)。痛風(fēng)不僅可以侵犯骨和關(guān)節(jié)，而且還容易累及腎臟和心血管系統(tǒng)。高尿酸血癥及原發(fā)性痛風(fēng)與肥胖癥、高脂血癥、高血壓病、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病呈顯著正相關(guān)。因此，痛風(fēng)是危害人類健康的一種嚴(yán)重的代謝性疾病。 近年來，隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，糖、脂肪、蛋白質(zhì)的攝入量明顯增加，高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)病率日益增高，己成為一種常見病.為了避免關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作和腎臟病變形成，痛風(fēng)患者需要長期服用有降低血尿酸作用的

3、藥物，但目前安全、有效、經(jīng)濟(jì)的降UA藥物較少。我國用中草藥治療痛風(fēng)病有悠久的歷史，但迄今尚無能夠有效降低血UA的中藥制劑用于臨床。因此，尋找新型降UA藥物，特別是借鑒中醫(yī)經(jīng)驗開發(fā)有降UA作用的中草藥制劑具有重要的意義。 本博士學(xué)位論文共分為四部分，第一部分建立可靠的高尿酸血癥動物模型；第二部分運用建立的高尿酸血癥動物模型，篩選具有降尿酸作用的中藥并初步探討其降尿酸機(jī)制；第三部分建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型，觀察中藥對急性痛風(fēng)性關(guān)

4、節(jié)炎的治療效果并分析其作用機(jī)制；第四部分應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分析急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型與正常小鼠之間及模型小鼠中藥治療前后血清蛋白質(zhì)譜的變化。本研究主要目的、方法、結(jié)果和結(jié)論概述如下：研究目的：建立高尿酸血癥及急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型，篩選具有降尿酸及抗炎鎮(zhèn)痛作用的中藥并分析其可能作用機(jī)制，應(yīng)用蛋白組學(xué)方法尋找急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型的血清蛋白標(biāo)志物，分析急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物中藥治療前后血清蛋白質(zhì)譜的變化。

5、 研究方法：1.雄性昆明小鼠隨機(jī)分組，分別用酵母膏、尿酸、氧嗪酸鉀鹽、酵母膏+乙胺丁醇、氧嗪酸鉀鹽+乙胺丁醇給藥制備動物模型。酵母膏按30g/kg/d灌胃給藥，每日2次，乙胺丁醇按250mg/kg灌胃給藥，每日1次，均連續(xù)用藥7天。尿酸、氧嗪酸鉀鹽分別按250mg/kg及300mg/kg一次性腹腔注射給藥。檢測建模前后各組小鼠血尿酸、血尿素氮、血肌酐水平的變化，電鏡觀察各組小鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)改變。2.選擇腹腔注射氧嗪酸鉀鹽法造模，雄性昆

6、明小鼠隨機(jī)分組，分別予苯溴馬隆20mg/kg和別嘌呤醇40mg/kg灌胃3天，觀察各組小鼠血尿酸及尿尿酸水平變化。3.雄性昆明小鼠隨機(jī)分為9組，采用腹腔注射氧嗪酸鉀鹽法建模，分別給予生理鹽水、黃柏、萆薢、土茯苓、澤瀉、車前子水煎液及別嘌呤醇、苯溴馬隆灌胃，每日1次，7日后觀察血尿酸水平及小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的變化.4.雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為6組，氧嗪酸鉀鹽腹腔注射建立高尿酸血癥動物模型，分別給予土茯苓、澤瀉、車前子水煎

7、液及別嘌呤醇、苯溴馬隆灌胃，每日1次，連續(xù)7天，收集第6-7天24h尿液，觀察各組大鼠尿量及尿尿酸濃度的變化.5.昆明小鼠隨機(jī)分為4組，采用MSU關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射誘導(dǎo)小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，土茯苓、澤瀉、車前子水煎液和吲哚美辛分別灌胃給藥，每日1次，連續(xù)6天。觀察給藥后關(guān)節(jié)腫脹度以及關(guān)節(jié)周圍組織炎癥介質(zhì)IL－1β和TNF-α水平的變化，并進(jìn)行關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查。 6.分別采用醋酸腹腔注射誘導(dǎo)小鼠扭體反應(yīng)法和熱板法的鎮(zhèn)痛實驗及蛋清、二甲苯誘導(dǎo)小

8、鼠足跖腫脹、耳腫脹的抗炎實驗，觀察土茯苓、澤瀉、車前子和吲哚美辛的鎮(zhèn)痛抗炎作用。7.用CM10芯片結(jié)合SELDI-TOF MS技術(shù)檢測正常組、模型組、土茯苓組各12只小鼠血清，Ciphergen ProteinChip 3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較模型組與正常組、模型組與土茯苓組間的蛋白質(zhì)譜峰差異，用判別分析方法建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠成模判斷模型，觀察模型小鼠中藥治療后蛋白質(zhì)峰的動態(tài)變化。 研究結(jié)果：1.尿酸組、氧嗪酸鉀鹽組、

9、氧嗪酸鉀鹽+乙胺丁醇組用藥后血尿酸水平較正常對照組均顯著升高(尿酸組從108.9±10.1 μmol/L升高到30 1.8±24.7μmol/L，P＜0.0 1;氧嗪酸鉀鹽組從11 9.1±20.6μmol/L升高到276.3±32.5μmol/L，P＜0.01：氧嗪酸鉀鹽+乙胺丁醇組從115.7±17.4μmol/L升高到282.2±40.7μmol/L，P＜0.01)。但酵母膏組、酵母膏+乙胺丁醇組血尿酸水平與正常對照組比較無顯著差

10、異。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，酵母膏組及酵母膏+乙胺丁醇組腎組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酵母膏組腎近曲小管上皮細(xì)胞線粒體多處出現(xiàn)局部嵴缺失、空化；酵母膏+乙胺丁醇組腎近曲小管上皮細(xì)胞核周池腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，形成大小不等的空泡。余用藥組腎組織超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯改變。2.采用氧嗪酸鉀鹽法建立小鼠高尿酸血癥動物模型，別嘌呤醇組和苯溴馬隆組小鼠用藥后血尿酸水平均明顯低于模型組。別嘌呤醇組小鼠尿尿酸濃度低于模型組，苯溴馬隆組尿尿酸濃度明顯高于模性組，說明此模型可用

11、于篩選降UA藥物。3.采用氧嗪酸鉀鹽法建模，黃柏、土茯苓、澤瀉組小鼠用藥后血尿酸水平下降，分別為171.2±28.8μmol/L、163.0±48.8μmol/L、158.7±45.2μmol/L，與模型組(250.4±55.8 μmol/L)比較有明顯差異；萆薢、車前子組小鼠血尿酸水平與模型組比較無明顯差異。黃柏、土茯苓組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性分別為73.23±7.21U/L、69.39±5.84U/L，與模型組(89.07±8.3

12、4 U/L)比較明顯下降，抑制率分別為20.0％和22.5％，但較別嘌呤醇29.2％的抑制率低。萆薜、澤瀉、車前子組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性與模型組比較無明顯差異。4.采用氧嗪酸鉀鹽法建立高尿酸血癥大鼠動物模型，澤瀉組大鼠尿尿酸濃度為187.50±46.81μmol/L，較模型組(136.02±11.55μmol/L)明顯增加，但低于苯溴馬隆組(23 1.55±29.32μmol/L)尿尿酸濃度，同時，澤瀉組大鼠24h尿量較模型組有增加

13、趨勢。土茯苓組大鼠尿量及尿尿酸濃度與模型組比較無明顯差異。5.小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSU溶液，24h后關(guān)節(jié)明顯腫脹，模型組小鼠腫脹關(guān)節(jié)周圍組織中炎癥介質(zhì)IL-1β和TNF-α水平明顯增高，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組小鼠軟骨破壞，滑膜組織充血、壞死伴炎細(xì)胞浸潤。土茯苓組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯減輕，關(guān)節(jié)周圍組織中炎癥介質(zhì)lL-1β和TNF-α水平顯著降低，關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變顯著改善。澤瀉、車前子組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度、病理檢查結(jié)果與模型組比較無明顯差異。6.土茯

14、苓1 2g/kg灌胃給藥能顯著減輕蛋清致小鼠足跖腫脹度及二甲苯致耳腫脹度；延長醋酸腹腔注射致小鼠扭體反應(yīng)的潛伏期，減少扭體次數(shù)；對熱板致小鼠疼痛反應(yīng)潛伏期與模型組無明顯差異，但有延長趨勢。澤瀉、車前子組小鼠鎮(zhèn)痛抗炎實驗結(jié)果與模型組比較無明顯差異。7.急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型組與正常組間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰27個。9個蛋白質(zhì)峰的t檢驗或Mann-Whitney秩和檢驗所得P值在10-4數(shù)量級以下.M/Z位于4612、12915、56

15、37、3018和23103Da的5個差異蛋白峰在模型組高表達(dá)，M/Z位于6456、4973、3923和15090Da的4個蛋白質(zhì)峰在模型組血清低表達(dá)；急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型組與土茯苓組間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰15個。其中6個蛋白質(zhì)峰的t檢驗或Mann-Whitney秩和檢驗所得P值在10-3數(shù)量級以下。M/Z位于2598、4614、3444、19686和3018Da的5個蛋白峰在模型組高表達(dá)，M/Z為2937的1個蛋白質(zhì)峰在中藥組

16、血清高表達(dá).4612Da和6456Da兩個蛋白質(zhì)峰組合所構(gòu)建的模型能達(dá)到鑒別急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠和正常小鼠的最佳檢測效果，總準(zhǔn)確率75.0％。4612Da在正常組低表達(dá)，模型組高表達(dá)；4614Da在模型組高表達(dá)，中藥治療后低表達(dá)，軟件分析二者為同一個融合峰，提示該峰可能為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的候選標(biāo)志蛋白質(zhì)峰。 研究結(jié)論：1.腹腔注射氧嗪酸鉀鹽法可作為建立高尿酸血癥動物模型、篩選降尿酸藥物的可靠方法。2.黃柏、土茯苓、澤瀉能降低高尿

17、酸血癥小鼠血清尿酸水平；土茯苓降低高尿酸血癥小鼠血尿酸水平的機(jī)制至少部分在于對肝臟黃嘌呤氧化酶的抑制作用；澤瀉降低高尿酸血癥小鼠血尿酸水平的機(jī)制可能主要在于促進(jìn)尿酸排泄及增加尿量。3.土茯苓能減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腫脹，減少炎細(xì)胞浸潤，降低局部組織炎癥介質(zhì)IL-1β和TNF-α的水平表明土茯苓有較強(qiáng)的抗炎及鎮(zhèn)痛作用。4.SELDI-TOF MS技術(shù)檢測到急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型與正常小鼠及模型小鼠與中藥治療組間血清蛋白質(zhì)譜的差異，對