apoA-Ⅰ對乙型肝炎病毒啟動子的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：篩選乙型肝炎病毒啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子并對其中之一的apoA-I因子與乙肝病毒各啟動子的相互作用進行深入研究。
　　 方法：首先采用等離子共振技術(shù)對乙型肝炎病毒啟動子結(jié)合蛋白進行篩選：將結(jié)合有親和素的HBV各啟動子耦聯(lián)在SA芯片上，使核酸序列游離于芯片之上，與流動相的HepG2.2.15細胞核蛋白充分接觸，洗脫并回收與啟動子結(jié)合的蛋白。該結(jié)合蛋白混合品經(jīng)short-gun質(zhì)譜分析，顯示在乙型肝炎病毒核心啟動子、S1、S2啟動

2、子的結(jié)合蛋白中，均有載脂蛋白A-I(apoA-I).隨后構(gòu)建含有apoA-I基因的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-apoA-I及含有HBVS1、S2、x啟動子的重組質(zhì)粒pCAT3-S1、pCAT3-S2、pcAT3-x。用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，以pcDNA3.1及pcAT3-basic為對照。細胞轉(zhuǎn)染48h后提取細胞蛋白，用檢測CAT的ELIsA試劑盒檢測各組蛋白中報告基因CAT含量。然后再采用等離子共振技術(shù)對apoA-I與各啟動子的

3、結(jié)合進行驗證及動力學分析：將apoA-I蛋白耦聯(lián)在CM5芯片上作為固定相，以各啟動子核酸片段為流動相，獲得該蛋白與各啟動子核酸的結(jié)合動力學參數(shù)，并利用激光共聚焦顯微鏡和western blotting對該蛋白在HepG2和HepG2.2.15細胞中的亞細胞定位及表達水平進行進一步的研究。
　　 結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示，乙肝病毒復制細胞模型HepG2.2.15細胞中apoA-I mRNA表達顯著高于無乙肝病毒復制