乙型肝炎病毒編碼蛋白對宿主炎性基因的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV），為嗜肝DNA病毒科家族成員，能夠引起一系列疾病，包括自限性急性肝炎、暴發(fā)性肝炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝細(xì)胞癌。慢性乙型肝炎病毒感染，仍然是一個嚴(yán)重危害健康的全球性疾病問題。據(jù)估計，目前全球約有四億人為慢性HBV感染者，我國是乙肝高發(fā)地區(qū)，其中1％的慢性乙肝發(fā)展為重型肝炎，預(yù)后差。HBV編碼病毒蛋白被認(rèn)為在肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，例如影響病毒的復(fù)制和調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)等。本實驗室前期的結(jié)果證明：HBV編

2、碼HBc蛋白和HBx蛋白能夠通過MAPK信號途徑激活轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2，使其與人纖維介素基因fgl2啟動子上的順式作用元件特異性結(jié)合，進(jìn)而激活該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 凋亡是人類肝臟疾病中最常見的肝細(xì)胞損傷機(jī)制。盡管有很多刺激和機(jī)制能夠引起凋亡，肝細(xì)胞卻特異性的對死亡受體引起的凋亡更易感。至少有三類腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員參與介導(dǎo)HBV感染時肝細(xì)胞的凋亡過程，分別為TNF、Fas 配體（Fasl）和腫瘤壞死因子相關(guān)凋

3、亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）。TRAIL為一類II 型跨膜蛋白，屬TNF超家族成員，通過與廣泛表達(dá)于靶細(xì)胞表面的TRAIL受體結(jié)合，繼而將凋亡信號傳遞給caspase，誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡，而對正常的細(xì)胞不發(fā)揮或發(fā)揮極微弱的作用。TRAIL在肝細(xì)胞死亡中的作用至今仍存在爭議，最初在動物模型中的研究認(rèn)為與TNF和Fasl不同，TRAIL并不引起正常肝細(xì)胞的凋亡。然而，隨著研究的進(jìn)一步開展發(fā)現(xiàn)，TRAIL能誘導(dǎo)病毒感染、脂肪酸浸潤后的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡

4、。在HBV導(dǎo)致的肝臟損害中，TRAIL的表達(dá)明顯增強(qiáng)，其表達(dá)水平與肝臟損害程度呈顯著正相關(guān)，提示TRAIL參與了HBV導(dǎo)致的重型肝炎的發(fā)病機(jī)制。
　　 首先，設(shè)計進(jìn)行了以下試驗來探討HBV編碼相關(guān)蛋白是否對人TRAIL基因具有激活作用。pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx分別為三種HBV編碼蛋白HBc、HBs和HBx的真核表達(dá)質(zhì)粒，將上述質(zhì)粒分別與hTRAIL啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒及pRL-TK海腎螢光

5、素酶對照報告基因質(zhì)粒（pRL-TK）共轉(zhuǎn)染到HepG2肝癌細(xì)胞系。來研究HBV編碼的蛋白是否對hTRAIL基因具有激活作用；若有作用，是何種病毒蛋白發(fā)揮活化基因的作用。通過檢測報告基因相對熒光素酶（LUC）值反映病毒蛋白對hTRAIL啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用，結(jié)果顯示，HBx蛋白能激活hTRAIL基因啟動子的轉(zhuǎn)錄；采用實時熒光定量和Western Bloting結(jié)果顯示相對熒光素酶的結(jié)果提示：在HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pcDNA-HBx組hTR

6、AIL基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對照組。而HBc蛋白和HBs蛋白則不能激活該基因的表達(dá)。
　　 為研究HBV編碼HBx蛋白作用下，參與激活hTRAIL基因的順式作用元件及反式作用因子，我們進(jìn)行了系列啟動子裁截缺失試驗，即構(gòu)建了一系列5’端缺失而具有共同3’端的hTRAIL基因啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒，將其分別與HBV編碼HBx蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。結(jié)果表明：在hTRAIL基因啟動子-89位至-29位（相對

7、于轉(zhuǎn)錄起始點）之間區(qū)域存在著重要的調(diào)控序列。為進(jìn)一步探討該區(qū)域內(nèi)是否存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，我們利用生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了分析，結(jié)果提示有三個主要候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點存在于hTRAIL基因啟動子的-89位至-29位之間。為了確定起決定作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，我們采用Quick-Change定點突變方法，對hTRAIL基因啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒的這三個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分別進(jìn)行定點突變，酶切結(jié)果和測序結(jié)果證實三個位點均突變成功。在H

8、epG2肝癌細(xì)胞系將HBx真核表達(dá)質(zhì)粒與突變后的hTRAIL啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實驗，檢測熒光素酶值結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HBx作用下，兩個sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分別突變后質(zhì)粒的相對熒光素酶活性降低50.1％和52.4％，而其他位點突變后相對熒光素酶活性沒有發(fā)生顯著性改變。凝膠遷移試驗表明，轉(zhuǎn)染病毒蛋白HBx真核表達(dá)質(zhì)粒后，HepG2細(xì)胞核蛋白能與含有sp1的hTRAIL基因啟動子探針特異性結(jié)合，而且轉(zhuǎn)錄因子sp1的抗體能使該結(jié)合條

9、帶發(fā)生遷移，凝膠遷移實驗說明HBx蛋白能使轉(zhuǎn)錄因子sp1與hTRAIL基因啟動子上相應(yīng)的順式作用元件位點發(fā)生特異性結(jié)合。用sp1抗體進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀試驗來研究在乙型肝炎病毒蛋白HBx作用下與轉(zhuǎn)錄因子sp1結(jié)合的DNA序列是否存在于是hTRAIL基因啟動子上的順式作用元件。結(jié)果表明：在HBx蛋白作用下，以與轉(zhuǎn)錄因子sp1結(jié)合的DNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增到長度為206bp的序列，該序列位于hTRAIL基因啟動子上，并包含-

10、89位至-29位（相對于轉(zhuǎn)錄起始點），進(jìn)一步證實在乙型肝炎HBx病毒蛋白作用下，sp1是激活hTRAIL基因所必需的轉(zhuǎn)錄因子。為了檢測轉(zhuǎn)錄因子sp1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，我們采用共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了HBx真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HBx后，在胞核及胞漿中均可見sp1蛋白的表達(dá)，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組以、HBs及HBc真核表達(dá)質(zhì)粒組相比，HBx組sp1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。采用RNA干擾的方法對HepG2細(xì)胞中sp1的表達(dá)進(jìn)

11、行干預(yù)實驗，結(jié)果顯示sp1表達(dá)的抑制可使hTRAIL啟動子熒光素酶的相對熒光素酶值降低64.8％，此結(jié)果進(jìn)一步證實了轉(zhuǎn)錄因子sp1是病毒蛋白HBx激活hTRAIL基因所必需的重要作用因子。上述試驗結(jié)果表明，病毒蛋白HBx激活宿主hTRAIL基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是通過活化轉(zhuǎn)錄因子sp1，后者發(fā)生核轉(zhuǎn)位，并與核內(nèi)hTRAIL基因啟動子（-89位至-29位之間）上的相應(yīng)順式作用元件特異性結(jié)合。
　　 以上結(jié)果說明，乙型肝炎病毒編碼HBx蛋白