miRNA-493靶向E2F1和RhoC抑制肺癌細胞增殖和轉移的作用及機制.pdf

1、研究背景與目的：
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，近十年其發(fā)病率和死亡率均迅速上升，在我國高居惡性腫瘤死亡率的首位，已成為嚴重威脅人們生命健康的重大疾病。根據(jù)肺癌的生物學特性，分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC約占80-85％，近年來，隨著治療方式的改進，治療方案的調整，肺癌的治療取得了長足的進步，但是大部分的NSCLC患者預后仍然較差，5年生存率仍低于15％。腫瘤轉移是導致肺癌患者死亡的最主要

2、原因之一，對肺癌的轉移機制研究雖然取得了很大的成績，然仍尚不明確。越來越多的研究證據(jù)提示了miRNAs等表觀遺傳學在腫瘤侵襲轉移中的重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常肺細胞，miR-493在肺癌細胞中表達普遍較低，以高轉移潛能的非小細胞肺癌95D細胞株尤為明顯。本研究擬在此基礎上，通過建立過表達miR-493的95D穩(wěn)定細胞株，利用一系列的分子細胞生物學方法對miR-493的生物學功能進行了研究，并對miR-493的靶基因進行預

3、測和驗證，進一步探討miR-493在肺癌中的調控機制。為開發(fā)miRNA成為腫瘤多種生物學行為的分子標志物提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　(1)構建miR-493慢病毒載體及空白對照載體，分別轉染95D細胞，建立過表達miR-493的穩(wěn)定細胞系95D/miR-493，以及對照組95D/control。并用實時熒光定量PCR驗證轉染效果。
　　(2)應用平板克隆形成實驗、細胞生長曲線檢測各組細胞的增殖能力，流式分析細胞周期

4、，Matrigel侵襲實驗和劃痕實驗檢測細胞侵襲和轉移，Hoechst染色檢測凋亡和MTS法檢測藥物敏感性等生物學行為的變化。
　　(3)采用實時定量PCR、WesternBlot技術檢測95D、95D/control和95D/miR-493細胞中RhoC、FZD4、IGF1R這3個靶基因的表達情況。
　　(4)利用RNAi技術干擾肺癌細胞中RhoC的表達水平，MTS法檢測干擾前后細胞5天（每天檢測一次）的生長狀況并繪制生長

5、曲線評價細胞的增殖能力。Transwell檢測處理前后細胞的侵襲能力的變化。Western blot檢測95D/miR-493和95D/si-RhoC及其各自的對照組細胞MMP2和MMP9的表達情況。
　　(5)利用生物信息學在線預測軟件分析并結合生物學功能及前期實驗結果，篩選出miR-493可能的靶基因E2F1。采用實時定量PCR、WestemBlot技術檢測95D、95D/control和95D/miR-493細胞中E2F1的

6、表達情況。將miR-493和重組有E2F1的3'UTR區(qū)序列的熒光素酶報告基因共轉染293細胞，24h后檢測報告基因的活性。
　　(6)利用RNAi技術干擾肺癌細胞中E2F1的表達水平，采用流式細胞術分析干擾E2F1前后的細胞周期分布，采用MTS法檢測干擾前后細胞5天（每天檢測1次）的生長狀況并繪制生長曲線評價細胞增殖能力。Westem blot檢測95D/miR-493和95D/si-E2F1及對照組細胞p21、cyclin D

7、2、ERK的表達及磷酸化狀況。
　　結果：
　　(1)以95D組中miR-493的相對表達量作為1，95D/con組和95D/miR-493組中miR-493相對表達量分別為(1.02±0.34)、(10.65±0.59)，過表達組(95D/miR-493)中miR-493的表達水平明顯高于空白組(95D)和陰性對照組(95D/control)(p＜0.01)。
　　(2)外源性過表達miR-493能使細胞周期發(fā)生阻滯

8、，G0/G1期細胞比例增多(80.77±4.22)％VS95D/control(43.70±2.33)％，S期細胞比例顯著減少(9.81±0.56)％VS95D/control(43.07±2.14)％;肺癌細胞的增殖能力和侵襲轉移能力明顯受抑制(p＜0.05)，而細胞凋亡和藥物敏感性方面無明顯變化。
　　(3)miR-493在95D細胞能抑制RhoC的表達而對FZD4和IGF1R表達無影響。RhoC的表達沉默能抑制95D細胞的侵

9、襲能力而對增殖能力無影響。95D/miR-493、95D/si-RhoC中的MMP2和MMP9的表達量均明顯低于其相應對照組。
　　(4)利用生物信息學在線預測軟件分析并結合生物學功能及前期實驗結果，篩選出miR-493可能的靶基因E2F1。實時定量PCR及WesternBlot發(fā)現(xiàn)E2F1的轉錄和蛋白水平表達均與miR-493成負相關。雙熒光素酶報告基因結果證實miR-493對E2F1表達具有直接抑制作用。
　　(5)E2

10、F1的表達沉默能使95D細胞G0/G1期細胞比例增高，S期細胞比例減少，生長曲線結果顯示E2F1干擾后細胞增殖速度減慢。95D/miR-493、95D/si-RhoC細胞cyclinD2表達明顯低于對照組細胞，P21表達均高于對照細胞，ERK磷酸化程度明顯低于對照組。
　　結論：
　　(1)成功建立了過表達miR-493的穩(wěn)定細胞株95D/miR-493及其對照細胞株。
　　(2)miR-493能抑制95D肺癌細胞增殖