酶降解膠原凝膠法制備無載體角膜上皮細(xì)胞片的實(shí)驗研究.pdf

1、目的： 報道一種利用膠原酶降解膠原凝膠制備無載體角膜上皮細(xì)胞片的新方法，并研究該細(xì)胞片的特性。 方法： 用Ⅰ型膠原制備膠原凝膠，通過稱重法研究膠原凝膠的穩(wěn)定性，并通過質(zhì)量損失法進(jìn)行膠原凝膠的降解實(shí)驗和膠原酶作用中止實(shí)驗，以確定膠原凝膠的降解情況和膠原酶作用中止的時間。在鋪有膠原凝膠的通透性培養(yǎng)皿 Tanswell insert上，用組織塊法培養(yǎng)兔角膜緣上皮細(xì)胞，使用氣液界面培養(yǎng)技術(shù)促進(jìn)復(fù)層上皮的形成，然后用特異膠

2、原酶降解膠原凝膠，并用膠原酶抑制劑中止酶的作用，制備復(fù)層上皮細(xì)胞片。HE染色和電鏡觀察細(xì)胞片組織形態(tài)，免疫組化觀測其蛋白表達(dá)，并通過檢測細(xì)胞片不同培養(yǎng)時間下的層數(shù)和活力以確定細(xì)胞片的最佳狀態(tài)時間。 結(jié)果： 1.用調(diào)節(jié)pH法成功制備透明、均勻的膠原凝膠。凝膠在37℃條件下，30天內(nèi)在PBS溶液中保持穩(wěn)定。 2.降解實(shí)驗顯示在0.1mg/ml(45U/ml)膠原酶溶液降解條件下，膠原凝膠在1.5h時完全降解；膠原酶降

3、解膠原的作用在3小時被膠原酶抑制劑胎牛血清和半胱氨酸的混合液中止。通過統(tǒng)計分析計算，在制備細(xì)胞片過程中，在膠原酶降解凝膠50分鐘時加入膠原酶抑制劑，可使膠原凝膠在完全降解的時刻，膠原酶的作用也剛好中止。 3.采用組織塊培養(yǎng)法，角膜緣上皮細(xì)胞在膠原凝膠上生長良好，具有良好的增殖和分化能力。2-3天細(xì)胞從組織塊周圍成片狀爬出；7-9天融合并形成單層，細(xì)胞呈圓形、卵圓形，細(xì)胞界限清楚，鑲嵌排列呈鋪路石狀，細(xì)胞融合成單層后；氣液界面繼續(xù)

4、培養(yǎng)7-9天，形成復(fù)層角膜上皮，細(xì)胞密集堆積，分不清細(xì)胞界限。 4.形成復(fù)層細(xì)胞片后，用膠原酶降解膠原凝膠，并用PVDF膜轉(zhuǎn)移，得到完整的無載體角膜上皮細(xì)胞片。HE可見細(xì)胞片在14天到17天時，細(xì)胞片形成4到6層的復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)：表層細(xì)胞呈現(xiàn)扁平狀外觀，中間細(xì)胞呈翼狀，底層細(xì)胞接近立方狀，與正常兔角膜上皮結(jié)構(gòu)相似。電鏡可見微絨毛、緊密連接和橋粒連接等超微結(jié)構(gòu)，和正常角膜上皮相似。 5.在培養(yǎng)14天到17天之間，角膜上皮細(xì)胞

5、片形成4-6層的復(fù)層結(jié)構(gòu)，沒有空洞，細(xì)胞活力也較好，表明構(gòu)建的細(xì)胞片在14到17天之間狀態(tài)較好。 6.免疫組化可見細(xì)胞片表達(dá)K3、K14，同時基底膜組分Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和整合素β1等在基底細(xì)胞表達(dá)陽性，緊密連接蛋白組分Occludin以及鈣粘蛋白組分Cadherin也表達(dá)陽性。 結(jié)論： 利用調(diào)節(jié)pH的方法，制備出在培養(yǎng)條件和時間內(nèi)穩(wěn)定存在的透明均勻的膠原凝膠，并成功地采用組織塊培養(yǎng)法在膠原凝膠上構(gòu)建出兔復(fù)層角