中國(guó)漢族單純型發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙家系的基因定位與克隆.pdf

1、目的: 本課題共收集了6個(gè)中國(guó)漢族PKD家系，將其與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的PKD家系進(jìn)行對(duì)比研究，深入挖掘中國(guó)漢族PKD家系自身特殊的臨床特點(diǎn)，并選擇具有代表性的家系進(jìn)行基因定位與克隆研究，定位中國(guó)漢族PKD新的致病基因位點(diǎn)，期待克隆出PKD的致病基因。 方法: 1)臨床研究：綜合已收集的6個(gè)PKD家系和中國(guó)已報(bào)道的12個(gè)PKD家系，與國(guó)外的42個(gè)PKD家系進(jìn)行臨床分析以及發(fā)病年齡、嚴(yán)重程度的配對(duì)t檢驗(yàn)和wilcoxon

2、符號(hào)秩和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2)基因定位：選擇家系結(jié)構(gòu)好、患病人數(shù)多的家系A(chǔ)進(jìn)行基因定位研究。首先選擇24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)涵蓋EKD1和EKD2的整條16號(hào)染色體進(jìn)行排除定位：在排除了家系與16號(hào)染色體的連鎖關(guān)系后，利用商業(yè)化的ABI全基因組連鎖試劑盒Linkage Mapping Setv.2.5-MD10進(jìn)行SIR全基因組掃描，并在全掃的陽(yáng)性區(qū)域內(nèi)進(jìn)一步增加微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)定位；為了進(jìn)一步驗(yàn)證STR掃描的結(jié)果，同時(shí)更加深入的挖掘該

3、家系所包含的遺傳信息，利用全基因組Linkage-12 SNP芯片對(duì)家系進(jìn)行的再次掃描和定位，并采用Genehunter-2-Iocus軟件對(duì)陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行2個(gè)致病位點(diǎn)相互作用檢驗(yàn)。 3)候選基因克?。翰捎霉δ?候選克隆的策略，篩選4個(gè)已知基因(KCNG3、SLC8A1、PRKCE和FGF12基因)作為候選基因進(jìn)行測(cè)序和突變分析。 結(jié)果: 1)臨床表型上，中國(guó)單純型PKD家系存在發(fā)病年齡逐代提前和(或)嚴(yán)重程度加重

4、的遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象：統(tǒng)計(jì)學(xué)上，中國(guó)單純型PKD家系代與代之間的平均年齡差為5.2歲，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(配對(duì)t檢驗(yàn)和Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)P值均<0.0001)，而復(fù)雜型PKD發(fā)病年齡并無(wú)顯著差異(P>0.01)。 2)參數(shù)和非參數(shù)分析排除了該家系的致病基因與16號(hào)染色體存在連鎖關(guān)系。STR全基因組掃描在D3S1580處獲得了最大的兩點(diǎn)LOD值1.75(θ=0)，其最大多點(diǎn)LOD值和NPL值分別為1.60和4.64( P=0.0

5、04)，將這個(gè)PKD家系的致病基因位點(diǎn)初步定位于D3S1262和D3S1311之間的區(qū)域。進(jìn)一步的精確定位在D3S3669處得到最大的LOD值2.82(θ=0)，NPL值9.83(P<0.0001);單體型分析將致病基因定位于D3 S1314和D3S1265之間約10.2 cM大小的區(qū)域，對(duì)應(yīng)NCBI的Marshfield圖譜，相當(dāng)于3q28-29的區(qū)域。全基因組SNP芯片掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)除3q28-29外，還存在另一個(gè)連鎖信號(hào)較強(qiáng)的區(qū)域2

6、p21-22，其位置分別位于2號(hào)染色體rs1509562至rs1016607之間約7.18cM(LOD值為2.35；NPL值為5.30；P<0.00001)和3號(hào)染色體rs10937369至rs711995之間約13.78cM(LOD值為2.39；NPL值為5.74;P<0.00001)的區(qū)域。兩位點(diǎn)相互作用檢驗(yàn)結(jié)果在基于倍增模型的前提下得到最大的two-locus LOD值3.81，同時(shí)最大two-locus NPL值也升至7.81(

7、P=0.0006)，提示PKD可能同時(shí)存在兩個(gè)致病基因位點(diǎn)2p21-22和3q28-29。 3)在對(duì)4個(gè)候選基因中的測(cè)序分析中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)DNA序列變異，其中有兩個(gè)DNA序列的改變導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生變化，但 未見與該P(yáng)KD家系的表型發(fā)生共分離，說(shuō)明這8個(gè)DNA序列變異均為單核苷酸多態(tài)，從而排除了這4個(gè)候選基因?yàn)樵揚(yáng)KD家系致病基因的可能。 結(jié)論: 1)發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙可分為單純型和復(fù)雜型兩種亞型