茯磚茶中冠突散囊菌分離培養(yǎng)及其發(fā)酵液胞外多糖與應(yīng)用酶學(xué)研究.pdf

1、茯磚茶具有獨(dú)特的品質(zhì)和明顯的調(diào)理人體消化及降脂減肥功能。冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯磚茶中的優(yōu)勢菌，與茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)和保健作用的形成有密切聯(lián)系。為了揭示二者的關(guān)系，本研究采用液體發(fā)酵技術(shù)、現(xiàn)代分離純化技術(shù)、高通量篩選技術(shù)和LC-MS定性分析技術(shù)對冠突散囊菌進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，獲得了如下研究成果： 1.冠突散囊菌的分離純化與液態(tài)發(fā)酵技術(shù) 本研究直接從茯磚茶中挑取黃色閉囊殼，采用PDA培養(yǎng)基和平板劃線

2、法，獲得了冠突散囊菌菌落。經(jīng)顯微鏡檢測和電鏡掃描，發(fā)現(xiàn)該菌株的菌落、菌絲、子囊果、子囊孢子的結(jié)構(gòu)和特征以及分泌物特性均具有典型冠突散囊菌的特性，經(jīng)過18s rDNA鑒定，確認(rèn)所分離的菌株為冠突散囊菌；該菌菌絲在液體發(fā)酵條件下緊密交織在一起呈菌絲球，并不斷增大，發(fā)酵后期出現(xiàn)部分衰老自溶。 采用單因素和正交試驗(yàn)對影響冠突散囊菌液體發(fā)酵的主要物質(zhì)條件和環(huán)境因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌生長時能很好的利用蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉和

3、乳糖，適宜生長的pH為4-6，黑茶汁能促進(jìn)其生長，其液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成為：0.8％黑茶浸提液加6％的蔗糖。影響冠突散囊菌液體發(fā)酵的環(huán)境因子依次為：初始pH值>培養(yǎng)溫度>接種量>搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)。冠突散囊菌液體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：初始pH值5.5、培養(yǎng)溫度30℃、接種量1％(孢子濃度為5.0～6.0×10<'8>cfu/mL)、搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)120r/min。 2.冠突散囊菌發(fā)酵過程中生化成分的動態(tài)變化 經(jīng)觀察，發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌液

4、體發(fā)酵過程中發(fā)酵液色澤隨發(fā)酵的進(jìn)行逐漸加深，由最初的橙黃色變成棕褐色，且由澄清變成混濁，但發(fā)酵液粘度變化較小，并且隨發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)酵液散發(fā)出越來越濃郁的特有的菌花香氣。 對冠突散囊菌液體發(fā)酵過程中有關(guān)生化成分的動態(tài)變化進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)： (1)冠突散囊菌液體發(fā)酵過程中菌絲的生長曲線呈S型，擬合的Logistic生長曲線方程為：y=0.371/(1+11.341e<'-0.051t>)(R<'2>=0.93607)，其生長過程

5、包括遲滯期(0-21h)、對數(shù)期(21-72h)、穩(wěn)定期(72-96h)和衰亡期(>96h)。菌絲生長量在發(fā)酵84h前不斷增加，第84h達(dá)到最大值0.3754g/100mL，發(fā)酵84h后部分菌體衰老減緩生長或停止生長，生長量呈下降的趨勢。 (2)冠突散囊菌液體發(fā)酵過程中，發(fā)酵液pH值呈下降趨勢。其中：0-48h，發(fā)酵液pH值從5.51下降到4.05，發(fā)酵至48h，發(fā)酵液的pH值達(dá)到最低值(pH4.05)，然后開始回升，96h-1

6、20h發(fā)酵階段，發(fā)酵液的pH值穩(wěn)定在5.00左右。 (3)冠突散囊菌液體培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液中氨基酸含量呈先下降后回升的變化，但總體呈下降趨勢。發(fā)酵0-84h，氨基酸總量下降了78.7％：發(fā)酵84h后，發(fā)酵液中氨基酸含量有所回升，發(fā)酵120h時，氨基酸含量上升到2.76mg/100mL。但發(fā)酵120h后，氨基酸含量下降了66.95％。說明，冠突散囊菌把氨基酸作為其生長繁殖的氮源物質(zhì)是導(dǎo)致茯磚茶加工中氨基酸含量下降的主要原因。

7、 (4)冠突散囊菌液體培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液中蔗糖含量逐漸減少，從發(fā)酵初期的5.95％降低到發(fā)酵終止時的2.57％。 (5)冠突散囊菌液體培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液中茶多酚、兒茶素總量明顯下降，發(fā)酵120h后，發(fā)酵液中茶多酚總量減少了60.45％，兒茶素總量降低了73.68％。發(fā)酵液中各組分兒茶素和茶黃素在不同發(fā)酵時期其含量有波動，但總趨勢是兒茶素和茶黃素減少，茶褐素大量增加(發(fā)酵120h后茶褐素增加了39.44％)，(TF+TR)/TB

8、呈先升后降變化。說明，冠突散囊菌分泌多酚氧化酶是引起兒茶素各組分大幅度減少的主要原因。 3.冠突散囊菌胞外多糖的提取、純化及其化學(xué)和生物活性研究 通過正交試驗(yàn)確定了冠突散囊菌液體發(fā)酵液胞外多糖提取的最佳工藝參數(shù)：濃縮比例為原液體的1/4，選用95％乙醇為沉淀劑，醇沉?xí)r間為10h。在該條件下，冠突散囊菌胞外多糖ECP(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和。ECP<'＃>(黑茶汁培養(yǎng)基)的提取量分別為195.2μg/mL和136.8μg/mL，其

9、粗多糖中總糖含量分別為62.2％和70.1％。 采用DEAE-52纖維素柱色譜和Sephadex G-100凝膠柱色譜對ECP和ECP<'＃>進(jìn)行分離純化。ECP經(jīng)DEAE-52分離得到4個組分，其中1.0 mol/L NaCl洗脫部分(ECP-A)為主要組分，占68.69％：ECP<'＃>經(jīng)DEAE-52分離得到4個組分，其中1.0 mol/L NaCl洗脫部分(ECP<'＃>-A)為主要組分，占46.83％；ECP-A和EC

10、P<'＃>-A再經(jīng)Sephadex G-100分離分別得到多糖ECP-A1、ECP-A2和ECP<'＃>A1、ECP<'＃>-A2，各多糖樣品經(jīng)UV掃描均不見蛋白質(zhì)和核酸的吸收峰；經(jīng)凝膠柱層析法測定其平均分子量分別為8.61×10<'4>Da，1.75×10<'4>Da，1.18×10<'5>Da和2.6×10<'4>Da；多糖TFA水解產(chǎn)物經(jīng)氣相色譜分析表明ECP-Al，ECP-A2，ECP<'＃>-A1和ECP<'＃>-A2的鼠李糖

11、：阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖分別為12.73：2.47：23.75：1：1.79；0.97：3.13：2.76：1：0.81；0.18：0.93：0.05：1：0.23；1.43：6.31：0.73：1：0.85。IR、高碘酸氧化和Smith降解研究表明ECP-A1、ECP-A2、ECP<'＃>-A1和ECP<'＃>-A2的結(jié)構(gòu)基本相似，均是不含糖醛酸的中性雜多糖，單糖殘基以吡喃型存在，主鏈以α(1→3)、α(1→6)、α(1→2

12、)或α(1→4)糖苷鍵連接。采用高通量篩選技術(shù)，以PPAR的三種亞型為受體，對冠突散囊菌胞外多糖的降脂減肥活性進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，冠突散囊菌胞外多糖對PPARα、PPARγ、PPARδ三種模型均有活性，而且對PPARγ模型有強(qiáng)的活性，ECP和ECP<'＃>對PPARγ模型激活值分別達(dá)1.63和1.41。以HepG2、K562細(xì)胞為試驗(yàn)對象對冠突散囊菌胞外多糖抑制腫瘤細(xì)胞的作用進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，ECP對K562細(xì)胞有一定的抑制作用，

13、但對HepG2細(xì)胞無抑制作用；ECP<'＃>對試驗(yàn)所選的2個模型細(xì)胞均無抑制作用。 4.冠突散囊菌發(fā)酵液的應(yīng)用酶學(xué)研究 采用體外模擬胃液和腸液環(huán)境研究了冠突散囊菌發(fā)酵液對α-淀粉酶、蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性的影響，并與綠茶、黑毛茶、茯磚茶和茶多酚復(fù)合物的作用進(jìn)行比較。結(jié)果表明，所有試驗(yàn)樣品對α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活性均有激活作用，冠突散囊菌發(fā)酵液和茯磚茶汁的激活作用明顯高于黑毛茶汁、綠茶汁和茶多酚復(fù)合物，冠突

14、散囊菌發(fā)酵液的激活作用最強(qiáng)，其對α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的激活能力分別是對照的1.6倍、3.98倍和3.61倍。茶多酚復(fù)合物對α-淀粉酶的激活效果表現(xiàn)出量效關(guān)系。所有試驗(yàn)樣品對脂肪酶活性均有不同程度的抑制作用。 5.茯磚茶中的綠原酸衍生物的定性分析 采用LC-MS定性分析技術(shù)研究了茯磚茶中綠原酸及其衍生物的存在和變化情況，首次發(fā)現(xiàn)在成品茯磚茶中存在兩種綠原酸衍生物，即1，4-diCQA和4，5-diCQA；在茯磚茶