亞抑菌濃度抗生素對紫色桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控研究.pdf

1、上世紀(jì)20年代末青霉素的發(fā)現(xiàn)，開辟了抗生素治療的新時代，許多感染性疾病從此得到了有效控制。但是，隨著抗生素的廣泛使用、錯用和濫用，細(xì)菌耐藥性越來越嚴(yán)重，涌現(xiàn)出了大量的耐藥菌、多重耐藥菌甚至超級耐藥菌株，這些問題已成為制約人類生存和發(fā)展的極大危機。我們國家是世界上抗生素濫用最嚴(yán)重的國家之一，每年約有8萬人死于抗生素泛濫使用導(dǎo)致的不良反應(yīng)，且死亡數(shù)量每年都在遞增，細(xì)菌耐藥問題和其他國家相比更加嚴(yán)峻。因此，如何解決細(xì)菌耐藥難題和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶

2、點研發(fā)新型抗生素已經(jīng)迫在眉睫。研究表明抗生素在低于治療劑量即亞抑菌濃度(subinhibitory concentrations)條件下引起的生物學(xué)效應(yīng)是臨床上引起細(xì)菌耐藥的一個重要因素。因此研究抗生素亞抑菌效應(yīng)不僅對分析細(xì)菌耐藥機理、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點具有重要作用，而且抗生素在亞抑菌濃度下產(chǎn)生的生理生化反應(yīng)對臨床給藥劑量和給藥時間都有非常重要的指導(dǎo)意義。
　　本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在紫色桿菌培養(yǎng)平板上卡那霉素抑菌圈外圍紫色菌素合成明顯

3、增強。實驗證明這種增強作用是由亞抑菌濃度卡那霉素引起，且其在1/4、1/6、1/8 MIC時均明顯促進(jìn)紫色桿菌紫色菌素合成，其中1/6 MIC促進(jìn)效果高達(dá)25％。這種現(xiàn)象在臨床常見抗生素阿米卡星、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素中同樣存在，但促進(jìn)效果均不如卡那霉素明顯。由于紫色桿菌中紫色菌素合成受群體感應(yīng)系統(tǒng)密切調(diào)控，我們采用熒光定量 PCR和生物報告菌株分析了亞抑菌濃度抗生素作用下紫色桿菌信號分子合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平和信號分子產(chǎn)量，實驗結(jié)果表明

4、亞抑菌卡那霉素明顯提高了群體感應(yīng)信號分子合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平和信號分子的產(chǎn)生。此外，群體感應(yīng)增強同時促進(jìn)了與其相關(guān)的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生和細(xì)菌生物被膜形成。進(jìn)一步研究顯示，在抗生素刺激下與紫色桿菌生物被膜形成相關(guān)的swimming, swarmming運動行為和聚集能力明顯增強。上述結(jié)果表明，亞抑菌濃度抗生素促進(jìn)紫色桿菌群體感應(yīng)行為發(fā)生。
　　c-di-GMP是細(xì)菌中普遍存在的第二信使，其調(diào)控的多種細(xì)菌行為如：細(xì)胞運動、生物被膜形成等均與

5、群體感應(yīng)系統(tǒng)相互交叉，暗示c-di-GMP信號系統(tǒng)和群體感應(yīng)信號系統(tǒng)相互關(guān)聯(lián)。在本論文中，我們采用雙親接合轉(zhuǎn)化方式成功將來自大腸桿菌的c-di-GMP合成基因adrA導(dǎo)入紫色桿菌中。當(dāng)過表達(dá)adrA時，紫色桿菌群體感應(yīng)行為明顯受到抑制。熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示adrA轉(zhuǎn)入后紫色桿菌群體感應(yīng)信號分子合成基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。信號分子定量分析也得到了一致的實驗結(jié)果。同時，受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的紫色菌素合成和幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生都受到明顯抑制。這些結(jié)果

6、表明，adrA可能通過增加c-di-GMP合成量來調(diào)節(jié)紫色桿菌群體感應(yīng)行為。
　　傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP監(jiān)測方法是利用放射性同位素對c-di-GMP合成底物GTP進(jìn)行標(biāo)記，然后利用薄層層析和放射自顯影監(jiān)測胞內(nèi)的同位素量，該方法對實驗條件要求高、操作繁瑣而且很難實時反映胞內(nèi)c-di-GMP含量。為了解決這一問題，我們利用c-di-GMP能夠作為核糖開關(guān)配體分子調(diào)控基因表達(dá)原理構(gòu)建了c-di-GMP核糖開關(guān)監(jiān)測模型并以此模型監(jiān)測

7、抗生素作用下細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平變化，從而確定抗生素是否通過第二信使調(diào)控細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)。首先，我們分別從霍亂弧菌VC16961、臘樣芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌基因組上克隆了六個c-di-GMP核糖開關(guān)(riboswitch)基因。然后分別利用sacB和lacZ報告基因成功構(gòu)建了6組c-di-GMP含量變化體內(nèi)檢測模型。通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化和功能驗證，我們獲得了一個特異性強，靈敏度高的c-di-GMP核糖開關(guān)生物檢測模型Ahy-1。利用此模型

8、我們檢測了亞抑菌濃度抗生素作用下紫色桿菌胞內(nèi)c-di-GMP含量變化，結(jié)果表明亞抑菌濃度抗生素下調(diào)了紫色桿菌胞內(nèi)c-di-GMP水平。由于c-di-GMP負(fù)調(diào)控紫色桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，因此我們認(rèn)為亞抑菌濃度抗生素能通過c-di-GMP信號通路調(diào)節(jié)紫色桿菌群體感應(yīng)行為。
　　綜上所述：本文我們發(fā)現(xiàn)并證明了亞抑菌濃度抗生素促進(jìn)紫色桿菌群體感應(yīng)發(fā)生，探究了c-di-GMP合成酶基因adrA轉(zhuǎn)入后對紫色桿菌群體感應(yīng)行為的調(diào)控，構(gòu)建并優(yōu)化了c