健擇對卵巢癌細(xì)胞株晝夜節(jié)律性的相關(guān)性研究.pdf

1、背景與目的：隨著生命科學(xué)的研究進(jìn)展，“生物鐘”的研究成為近年生命科學(xué)研究的熱點。國際權(quán)威雜志(Science)認(rèn)為“生物鐘的研究可能改變?nèi)祟悓ψ匀坏恼J(rèn)識，從而產(chǎn)生重大社會和經(jīng)濟(jì)效益、有重大突破的研究領(lǐng)域”。將生物鐘的理論引入疾病的治療中則形成時間治療學(xué)(Chronotherapy)，且在許多疾病的治療中具有獨特優(yōu)勢，尤其在腫瘤的化療方面。鑒于化療藥物的毒性及有效性是矛盾的兩個方面，許多學(xué)者正試圖通過基因靶向等方法來減少毒性、提高療效，但

2、目前仍處于臨床探索階段，尚未發(fā)現(xiàn)有更好的方法來達(dá)到此目的，故時辰化療有可能在這方面有所突破。目前在世界范圍內(nèi)，已經(jīng)開展了在基礎(chǔ)、臨床等方面的研究，并已經(jīng)取得初步成果，目前大部分化療藥物已經(jīng)具備了時辰化療方面的基礎(chǔ)和臨床研究數(shù)據(jù)，選擇“健擇”作為本實驗化療藥物，目的在于目前它在臨床治療卵巢癌上作為二線藥化療。它作為細(xì)胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細(xì)胞，即S期細(xì)胞，在一定條件下，可阻止G1期向S期的進(jìn)展；對各種培養(yǎng)的

3、人及鼠腫瘤有明顯的細(xì)胞毒性，且健擇與時間藥理學(xué)有關(guān)的實驗數(shù)據(jù)尚未見國內(nèi)文獻(xiàn)報道。本實驗采用檢測和選用ER，PR受體陽性率達(dá)50％的卵巢癌細(xì)胞株作為實驗材料，是因為此類細(xì)胞生物特性更接近人的卵巢癌細(xì)胞。而且可以在小鼠體內(nèi)時辰化療的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究在沒有下丘腦．視上核對光調(diào)控的體外卵巢癌細(xì)胞株對化療藥物是否有晝夜變化。國外僅有少數(shù)報道關(guān)于化療藥物在體外對癌細(xì)胞株作用24小時晝夜節(jié)律，國內(nèi)尚無類似研究，且本實驗研究化療藥物在體外對癌細(xì)胞

4、株作用48小時節(jié)律，這樣結(jié)果將更可靠。從而為臨床制定這種藥的時辰化療方案提供必要的實驗依據(jù)。 方法 第一部分 用單克隆抗體免疫組化兩步法：測定體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，HO8910，A2780ER、PR濃度，采用鼠抗人單克隆抗體Estrogen Receptor，該抗體為識別分子量67kDa的雌激素抗體。鼠抗人單克隆Progesterone Receptor該抗體特異性識別人孕激素受體。免疫組化染色二步法，

5、按照說明書步驟進(jìn)行。切片由ER、PR的染色均定位于腫瘤細(xì)胞漿與細(xì)胞核中。采用免疫組織化學(xué)積分即Hscore積分法進(jìn)行結(jié)果判定。染色結(jié)果綜合染色強(qiáng)度和染色范圍進(jìn)行半定量處理。陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)構(gòu)清晰；(2)著色明顯區(qū)別于背景，Hseore=gvi(i+1)，i為染色強(qiáng)度。所有染色玻片確保相近的實驗條件。i根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅳ級：O為陰性；(+)染色弱，但明顯高于陰性對照；(++)染色清晰；(+++)染色強(qiáng)。+、++、+++3個染色強(qiáng)度分

6、別用i．1，2，3表示。i=0時，染色陰性，積分為0，Pi為每一染色強(qiáng)度范圍內(nèi)陽性癌細(xì)胞數(shù)占切片所有癌細(xì)胞的百分值。這樣將切片中所有陽性癌細(xì)胞染色強(qiáng)度及其百分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值并累加起來，達(dá)到對ER、PR染色半定量的目的。確定Hseore≥75為陽性，Hseore<75為陰性。 第二部分 1．用MTT法檢測健擇對三種卵巢癌細(xì)胞的IC50計算：將三種細(xì)胞制成×10<'4>個細(xì)胞/ml懸液，種植于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100u

7、l。試驗設(shè)十五種不同濃度健擇(50ug/ml，100ug/ml,200ug/ml，400ug/ml,600ug/ml,800ug/ml，1000ug/ml,2000ug/ml,3000ug/ml,4000ug/ml,5000ug/ml,6000ug/ml,7000ug/ml，8000ug/ml，10000ug/ml)的試驗組(每孔加用藥100ul)及試劑對照組，按公式抑制率=1一試驗組平均值/對照組平均值計算各種藥物濃度的抑制率及中效濃

8、度(IC50)，試驗重復(fù)3次取平均值2．將受體陰陽性細(xì)胞作為對照組制成1×10<'4>個細(xì)胞/ml懸液，種植于96孔酶聯(lián)反應(yīng)培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100ul，再用各個細(xì)胞健擇IC50濃度按12個時點連續(xù)48小時0：00，04：00，08：00，12：00，16：00，20：00，0：00，04；00，08：00，12：00，16：00，20；00培養(yǎng)24小時，在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞已覆蓋孔底50-60％加藥進(jìn)行實驗，再培養(yǎng)24小時后，繼續(xù)加藥連

9、續(xù)48小時后，用MTT法檢測細(xì)胞的各時辰點抑制率，結(jié)果經(jīng)SPSS檢驗P值，它們的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果 (1)卵巢癌細(xì)胞A2780ER(+)，卵巢癌細(xì)胞株A2780PR(-)，卵巢癌細(xì)胞SKOV3ER(-)，卵巢癌細(xì)胞SKOV3PR(++)，卵巢癌細(xì)胞HO8910ER(++)卵巢癌細(xì)胞HO8910PR(-)(2)卵巢癌細(xì)胞A2780IC50為2000ug/ml，卵巢癌細(xì)胞SKOV3IC50為2000ug/ml，卵巢癌細(xì)胞HO8910I

10、C50為100ug/ml(3)經(jīng)SPSS軟件分析，a三組卵巢癌細(xì)胞株殺傷率有晝夜節(jié)律差異性：不同時辰點的健擇對卵巢癌細(xì)胞株HO8910的抑制率存在明顯的晝夜節(jié)律，有統(tǒng)計學(xué)意義，其峰谷值由脈沖圖可以看出，峰值是第二天凌晨0am-4am，此時用藥，對卵巢癌細(xì)胞的抑制率最大。谷值第一天早上8am-12N之間，此時殺傷率最低。不同時辰點的健擇對卵巢癌細(xì)胞株SKOV3抑制率存在明顯的晝夜節(jié)律，有統(tǒng)計學(xué)意義，峰谷值由余弦圖可以看出峰值是第二天凌晨0

11、am-4am，谷值第一天凌晨0am-4am之間或第二天凌晨4am-8am,不同時辰點的健擇對卵巢癌細(xì)胞株A2780在體外48小時的抑制率晝夜節(jié)律無統(tǒng)計學(xué)意義b．同種細(xì)胞第一天晝夜節(jié)律與第二天晝夜節(jié)律差別性：健擇對卵巢癌細(xì)胞株HO8910的抑制率第一天峰值和谷值分別0am和8am，第二天峰值和谷值分別0am和20pm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，第二天峰值的抑制率明顯大于第一天峰值此時用藥，對卵巢癌細(xì)胞的抑制率最大。健擇對卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的抑

12、制率第一天峰值和谷值分別12N和4am第二天峰值和谷值分別4am和16pm差異有統(tǒng)計學(xué)意義，第二天峰值的抑制率明顯大于第一天峰值c不同劑量的藥物對同種細(xì)胞作用晝夜節(jié)律差別性：健擇分別為2000ug/ml和3000ug/ml對SKOV3在體外48小時不同時點用藥抑制率抑制率存在晝夜節(jié)律，兩者峰值是第二天凌晨0am-4am，此時具最強(qiáng)殺傷功效。劑量2000ug/ml健擇谷值第一天凌晨0am-4am之間，劑量3000ug/ml的健擇谷值第二天

13、凌晨4am.8am。d同劑量的藥物對不同細(xì)胞作用晝夜節(jié)律不同：劑量為2000ug/ml的健擇對SKOV3,A2780的抑制率在第一天峰谷值剛好相反，健擇對SKOV3的抑制率處峰值時對A2780的抑制率處谷值。 結(jié)論： (1)健擇對ER(++)PR(-)卵巢癌細(xì)胞HO8910在體外作用48小時不同時點用藥抑制率殺傷率呈晝夜節(jié)律但有差異性，峰值是第二天凌晨0am-4am健擇對ER(-)PR(++)卵巢癌細(xì)胞SKOV3在體外48小時不